总结酵母酶活测定.docVIP

2.9.3 B -Galactosidase 酶活定量实验 参考 Clontech Yeast Protocols Handbook 进行。 准备：每个样品，8 ml的YPD培养基，Y190菌株（转化用）。 Z buffer, Z buffer+beta-^基乙醇，Z buffer+ONPG, NA2CO3 1） 准备5 ml SD/-Leu /-Trp液体培养基过夜培养的酵母菌，同时将ONPG 溶解在Z缓冲液中（4 mg/ml,调pH 7.0）并振荡混匀1-2 hr； 2） 旋涡振荡器上将菌液剧烈振荡0?5?1 min,立刻取出2 ml加入8 ml的 YPDA 中； 3) 30°C 250 rpm摇3-5 hr,测ODgoo在0.5-0.8之间并记录确切OD值; 4）取3个l?5ml的EP分别倒入l?5ml菌液，14,000 rpm离心30 sec,小 心弃上清，加入1.5 mlZ缓冲液，振荡以重悬菌体; 5） 离心去上清，加入300川Z缓冲液重悬菌体（则浓缩倍数为1.5/03=5倍）; 6） 取0?lml至新管中，液氮冷冻0.5-1 min, 37°C 0.5-1 min使其融化； 7） 反复冻融3次以上使细胞尽可能破碎； 8） 取一个新管加入100 pl Z缓冲液作为空白对照； 9)每管中加入0.7 ml Z 9) 每管中加入0.7 ml Z缓冲液+ B -銃基乙 加入160川溶在Z缓冲液 中的ONPG同时开始计时，将管置于30°C温浴; 10） 当溶液变为黄色时，加入0.4 ml Na2CO3中止反应，计录反应时间t； 11） 14,000 rpm 离心 10 min,取上清，测 OD420 值； 计算 B -Galactosidase 酶活: B ?Galactosidase units=l ,000 X OD420 （t X V X OD60（）） t为反应时间（第10步记录） V为0.1X浓缩倍数（第5步记录） OD60o为第3步所测OD值 2.9.4提取酵母蛋白 参考 Clontech Yeast Protocols Handbook 进行。 1）接酵母菌于SD/-Leu /-Trp培养基中，30°C摇培过夜; 2）扩培至50 ml YPDA培养基中，30°C摇培至006。。为0.4-06 计算总ODgoo值：测得的OD6oo值X培养液体积； 3）将菌倒入预冷的离心管中，4°C 1000X^5 min,弃上清，细胞 重悬于50 ml预冷的超纯水中； 4）4°C 1000X^5 min,弃上清，冷的超纯水再洗一次，沉淀冻到 液氮中，继续下面的实验或冻存于-80°C； 5）每7.5 OD600加入100 gl 60°C预热的裂解缓冲液（用前加入 PMSF和cocktail,因PMSF有半衰期，需每隔7 min补一次），60°C 水浴小于2 min使菌体融化并重悬起来; 6） 转移到1.5 ml的EP管中，加入适量glass beads （80 gi/7.5 OD60o），70°C 10 min,剧烈振荡 1 min； 7） 4°C 14,000 rpm离心5 min,将上清转移至新的EP管中并置 于冰上； 8） 沉淀置于 100°C 3-5 min,剧烈振荡 1 min, 4°C 14,000 rpm 离 心5 min,小心吸取上清，并将两次的上清合到一起； 9） 100°C 10 min 煮样，即可进行 western bloto 试剂配置 YPDA 培养基：1 L 配方:20 g Difo peptone, 10 g Yeast extract, 15 ml 0.2% adenine hemisulfate solution9 加水至 950 mb 灭菌后冷 却至55°C再加入50 ml 40%的葡萄糖(葡萄糖溶液可112°C灭菌或抽 滤灭菌)，若为固体培养基灭菌前还需加20 g/LAgar； SD/-Leu /-Trp 培养基：6.7 g/L Yeast nitrogen without amino acids, 0.67 g/L -Leu /-Trp DO supplements 若为固体培养基需加 20 g/L Agar, SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp 培养基：6.7 g/L Yeast nitrogen without 若为固amino acids9 0.6 g/L -Ade/-His /-Leu /-Trp DO supplements 若为固 体培养基需加20 g/LAgar,灭菌; 贮存液：10XTE： 0.1 M Tris-HCl, 10 mM EDTA,调 pH 7.5 灭菌, lOXLiAc： 1 MLiAc,乙酸调 pH 7.5 灭菌, 50% PEG4000； PEG/L