弓形虫p24基因敲除质粒的构建及缺陷型虫株建立方法的初步研究微生物学专业论文.docxVIP

硕士学位论文 硕士学位论文 中文摘要 摘要 研究目的： 建立弓形虫P24基因缺陷型虫株，并对缺陷型虫株建立的条件进 行探索。 研究方法： (1)弓形虫P24基因敲除转染质粒pGB／P5一P3的构建 根据TgP24基因序列，设计并合成两对特异引物(P1 to P4)， 采用PCR技术特异扩增TgP24基因的5’端非翻译区2．5 kb片段(P24 5’UTR)和3’端非翻译区2．89 kb片段(P24 3 UTR)，将其分别亚 克隆入pCR2．1-TOPO TA载体。构建质粒P24 5’UTR／TA和P24 3’UTR／TA；重组质粒P24 5’UTR／TA经Kpn I和Bgl II双酶切后， 再将纯化的P24 5’UTR片段亚克隆入转染质粒GRA2／B1e的Kpn工和 Bgl II位点，构建重组质粒pGB—P5(GRA2／B1e—P24 5’UTR)；重组质 粒P24 3’UTR／TA经BamH I和Not I双酶切后，纯化P24 3’UTR片 段，再将其定向克隆到重组质粒pGB—P5的BamEI和Not I位点。从 而构建TgP24基因敲除转染质粒pGB／P5一P3。 (2)弓形虫P24基因缺陷型虫株筛选条件的建立 采用微孔滤膜(孔径为5．Oum)过滤法纯化弓形虫速殖子；比较 观察电穿孔条件，如电转染缓冲液，电压，电容，脉冲次数对质粒转 染虫株的影响。体外比较观察不同宿主细胞(HFF，3T3和L929)对 转染虫株药物筛选的影响：比较观察单独细胞内药物筛选和结合细胞 外药物低温处理对虫株筛选的影响(细胞中选择培养10天左右，收集 虫体，4。C下福来霉素处理5天，再回复到细胞内用选择培养基培养约 7天)。 (3)弓形虫P24基因缺陷型虫株的建立及鉴定分析 应用优化条件的电穿孔方法转染RH株速殖子，以已建立的最佳筛 选条件对虫株进行筛选，将虫株继续在细胞中传代培养(12hr)，高 倍显微镜下，观察纳虫泡的形成并计数，然后大量收集纯化虫株，用 RT—PCR及Western．blot两种方法对各组弓形虫P24基因缺陷型虫株的基 因及其蛋白表达进行分析，并对虫株的毒力变化进行了初步观察。 硕士学位论文 硕士学位论文 中文摘要 研究结果： (1)弓形虫TgP24基因敲除转染质粒pGB／P5一P3经过PCR筛选、限 制性酶切及DNA测序鉴定，证实P24 5’UTR和P24 3’UTR两片段 正确插入质粒GRA2／B1e的Kpn I和BglII及Band／I和Not I位点， 位于药物选择ble基因的上，下游。 (2)显微镜检查发现速殖子纯度可达95％，滤膜过滤虫体后，回收 率也可达70％-80％；通过比较观察发现，优化电穿孔条件后的弓形虫 存活率得到提高(PO．05)；采用将细胞内筛选和细胞外药物低温处 理相结合的方法对虫株进行筛选较彻底；采用L929成纤维细胞做为 转染虫株筛选的宿主细胞其易贴壁生长形成单层，个体较大，细胞传 代次数多，生长速度较慢，并且对筛选药物的耐受力为三种细胞中最 理想的。 (3)高倍显微镜下计数，12hr左右转染虫株在细胞中纳虫泡数为8 个／hp，明显低于RH速殖子形成的纳虫泡数19个／hp(P0．05)；获 得的转染虫株经RT—PCR，Wes．tern—blot检测，结果显示L929细胞筛 选组虫株的基因及蛋白水平均明显低于HFF和NIH一3T3细胞筛选组虫 株：动物毒力试验结果表明，L929细胞筛选组虫株感染小鼠的平均存 活时间长于对照组RH虫株。 结论： (1)成功构建了弓形虫P24基因敲除转染质粒pGB／P5-P3，并且插 入的靶基因两端的片段较长，有利于提高同源重组效率。 (2)确定了弓形虫电穿孔技术的应用条件以及TgP24基因敲除质粒 转染虫株在不同哺乳动物细胞中的最佳筛选条件(采用细胞内筛选和 细胞外药物低温处理相结合的方法，福来霉素浓度为 5．0 u g／ml-7．5 u g／ml，采用L929成纤维细胞做为基因敲除虫株筛选 的宿主细胞筛选时间较长，筛选效果好)。 (3)初步获得了弓形虫P24基因缺陷型虫株，为进一步研究弓形虫 TgP24基因缺陷型虫株的生物学特性打下了良好的基础。 关键词 弓形虫，电穿孔，基因敲除，哺乳动物细胞 硕士学位论文 硕士学位论文 英文摘要 ABSTRACT Objective： To establish TgP24 gene—knockout strains，and Exploration on the app