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ESC和成体干细胞的异同 相同点:都具有干细胞的自我复制和分化能力,都有“归巢”现象。 干细胞是一类能够进行自我更新和具有分化潜能的细胞 (具有分裂增殖能力,干细胞本身不是处于分化途径的终 端)。 干细胞通过两种方式生长 *对称分裂---形成两个相同的干细胞 *不对称分裂---由于细胞质中的调节分化蛋白不均匀地分 配,使得一个子细胞不可逆的走向分化的终端成为 功能专一的分化细胞;另一个保持亲代的特征,仍 作为干细胞保留下来。 干细胞的共同特征 干细胞增殖的缓慢性 干细胞增殖的自稳性 区别于肿瘤细胞的本质性特征。 有利于其对特定的外界信号做出反应,以决定是进入增殖还是进入分化程序,同时有利于减少干细胞内基因突变的危险。 研究干细胞增殖和分化机制的最终目的是应用干细胞治疗疾病。理论上讲,干细胞可以用于许多疾病的治疗,像帕金森氏病、糖尿病、心肌梗死、肝功能衰竭等。就是干细胞的这种潜在的价值引起了各国学者的研究兴趣。 干细胞的应用 胚胎干细胞embryonic stem cells 干细胞相关技术:克隆clone 转基因技术transgenic technology 成体干细胞:神经干细胞neural stem cells 肺干细胞pulmonary stem cells 诱导型多能干细胞induced pluripotent stem cell 主 要 内 容 第2周 第3周 胚胎干细胞(embryonic stem cell, ESC)是从早期胚胎的 内细胞团中分离出来的一种高度未分化、具有多向分化潜能的细胞。 1981年Evans等从囊胚的内细胞群中成功分离、建立了小鼠的ESC系 1998年Thomson和Gearhart分别用胚泡内细胞团细胞和原始生殖细胞成功地建立了人的ESC系 在全球范围内掀起了ESC的研究热潮。 胚胎干细胞 ESC的体外培养建系 定向诱导分化 在生物医学上的应用 早期小鼠胚胎的获得: 受精后第4天上午,取出孕子宫,将输卵管端夹闭,由阴道端插入5号针头注入冲胚液,至宫腔达到一定压力,突然松开输卵管侧,即可获得发育至囊胚期的早期胚胎。选取发育良好的囊胚接种在饲养层细胞上。 从小鼠囊胚的内细胞群中分离培养ESC 子宫 小鼠早期胚胎的体外培养---饲养层: 饲养层细胞的作用: 培养的鼠胚成纤维细胞经丝裂霉素C处理后,可用作饲养层细胞。 饲养层细胞经丝裂霉素C处理后,虽然失去分裂能力,但仍然保持生存活性,并为胚胎干细胞的存活、增殖和未分化状态的维持提供一些必需因子,还可去除培养环境中的毒素和代谢抑制因子。 饲养层细胞的处理方法如下: 取P12-16的孕鼠,剖腹取胚胎,去除头、四肢、内脏后,Hanks液反复冲洗,剪碎鼠胚组织,胰酶消化成单细胞悬液,接种,即为原代培养鼠胚成纤维细胞。将原培养液弃去,加入含10μg/ml丝裂霉素C的培养液作用2-4h,然后胰酶消化制成单细胞悬液,接种在四孔板中备用。 从小鼠囊胚的内细胞群中分离培养ESC 小鼠早期胚胎的体外培养: 从小鼠囊胚的内细胞群中分离培养ESC ESC的分离培养: 待小鼠囊胚贴壁,并从透明带中孵出后,在显微操作仪下分离内细胞团,吸出内细胞团,用胰酶消化,将其离散成小的细胞团块,接种于新的铺有饲养层细胞的四孔板中。一周后即可出现ESC集落。 从小鼠囊胚的内细胞群中分离培养ESC ESC的分离培养---饲养层: ESC体外培养的条件非常严格,为了维持ESC的未分化状态, 在体外培养过程中,必须有饲养层或其它分化抑制剂的支持, 适宜的饲养层培养体系是ESC体外培养扩增的一个关键环节。 从小鼠囊胚的内细胞群中分离培养ESC 原代鼠胚成纤维细胞(primary mouse embryonic fibroblast, PMEF)以其易于取材、分化抑制效果好等特点而被广泛应用。 目前常用的饲养层有:STO(SIM小鼠成纤维细胞株,并为抗硫 代鸟嘌呤6-thioguanine和鸟本箭毒素甙鸟巴因oualiain选择过的 细胞)、PMEF(原代培养鼠胚成纤维细胞)、SNL(G418R基因和 LIF基因转染的STO)、HBC-5637等。 随着对人ESC研究的深入,来源于人ESC的组织器官可望用于 临床。在体外培养人ESC时多使用PMEF作为饲养层,这样
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