wnt通路对不同类型细胞重编程影响差异的分子机制生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

目 目 录 摘!19{1．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．1 中文摘要 ．1 英文摘要 ．3 正文 ．5 第1章前言 ．．5 一、研究背景 5 二、研究现状 ．5 l、诱导多能干细胞 ．．5 2、重编程过程中事件发生和起始细胞 ．．5 3、Wnt信号通路 ．．6 4、Tcf／Lefl转录因子家族 8 三、研究价值 9 第2章材料和方法 l 0 一、材料 10 l、实验动物 l 0 2、实验质粒 10 3、实验试剂与培养基 10 4、实验耗材与仪器 12 二、方法 l 3 1、实验细胞获取 ．．1 3 万方数据 2、iPS多能性鉴定 2、iPS多能性鉴定 ．．15 3、基因的表达和定位的检测 ．1 5 4、蛋白相互作用检测 18 5、基因表达载体的构建 18 6、病毒组装与感染 22 7、蛋白与DNA相互作用检测 23 8、ES细胞系的建立和分化 24 第3章实验结果 26 一、MEF与HSPC具有不同的重编程速率 ．26 二、MEF和HSPC在重编程过程中有不同的信号响应 ．26 三、D—catenin在HSPC中上调明显 27 四、Tcf／Lefl的响应和功能 29 五、Tcf／Lefl下游靶点分析 3l 六、Wnt信号对ES的影响 ．35 第4章讨论 37 第5章 结论 39 第6章参考文献 4 0 综述 43 经典Wnt信号通路在干细胞中的研究进展 43 参考文献 4 8 攻读学位期间发表文章情况 。51 致谢 52 万方数据 大连医科大学硕：￡学位论文Wnt通路对不同类型细胞重编程影响差异的分子机制 大连医科大学硕：￡学位论文 Wnt通路对不同类型细胞重编程影响差异的分子机制 硕士生姓名：李浩兰 指导教师：康岚教授 专业名称：生物化学与分子生物学 摘要 实验目的： 1．确定不同类型的体细胞，包括小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse Embryonic Fibroblasts，MEF)以及小鼠造血T／祖细胞(Hematopoietic Stem／Progenitor Cells， HSPC)重编程速率以及效率的差异。 2．探究Wnt通路调控对不同类型细胞重编程影响的异同。 3．阐明wnt信号通路下游TcffLefl转录因子在不同类型成体细胞的效应，解 析其DNA结合位点的差异，揭示Wnt信号对各细胞重编程的效应的分子基础。 实验方法： 首先，利用已经成功建立的二次诱导体系，获得能够直接添加强力霉素 (Doxycycline，Dox)启动内源Oct4，Sox2，Klf4和c—Myc表达来诱导重编程的MEF 及HSPC，对重编程得到的克隆的形成的速率和效率进行统计比较。接着，依据已 经得到的RNA．seq结果，利用Gsk313抑制剂CHIR99021以及IWRl．endo对Wnt 信号通路进行激活或者抑制，同样通过统计重编程得到的克隆的形成速度以及数 量来确定wnt信号通路对不同类型细胞重编程的影响。接着，利用实时荧光定量 PCR和Western Blot在mRNA水平和蛋白水平检测Wnt通路中核心因子13-catenin 以及下游TcffLefl转录子家族成员的表达水平，利用Co—IP来确定MEF和HSPC 中13-catenin与Tcf／Lefl的相互作用，结合小分子抑制剂引起的表达水平改变情况， 确定在不同类型细胞中起到关键作用的转录因子，并利用过表达以及敲降的手段 明确它们在响应细胞中的功能。最后利用ChIP．seq深度解析不同类型细胞中关键 转录因子结合的DNA序列，分析Wnt通路调控的下游靶基因，揭示Wnt信号对 万方数据 大连医科大学硕士学位论文不同类型各细胞重编程的区别效应的分子基础。 大连医科大学硕士学位论文 不同类型各细胞重编程的区别效应的分子基础。 实验结果： 1．Wnt的激活与抑制对MEF和HSPC重编程具有不同的作用模式 利用CHIR99021来激活Wnt信号通路能够促进HSPC的重编程，抑制MEF 的重编程。而利用IWRl．endo来抑制Wnt信号通路对HSPC以及MEF的重编程 影响均不大。 2．MEF及HSPC对Wnt信号的响应不同，引起不同的b-catenin以及Tcf／Lefl 效应 HSPC中Ij-eatenin的表达水平较MEF低，而加入CHIR99021后发现能够明显 提高HSPC中13-eatenin的蛋白水平，但MEF中13-eatenin对CHIR99021的响应并 不显著。CHIR99021的加入在MEF以及HSPC中引起Tc