不同真菌来源的atp柠檬酸裂解酶基因的克隆与表达-微生物学专业论文.docxVIP

I吣Y帆2㈣0 I吣Y帆2㈣00讯4㈣0 29讯 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 如需保密，解密时间 年 月 日 是否保密 ，／占 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定．与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意． 研究生签名：武够‘ 时间：易f7年／月1日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印剧本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文．本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，并授权中国科学技术信患研究所和北京万方数据股份有限公司将本人 学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并进行信息服务(包括但不限于汇编、 复制、发行，信息网络传播等)，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力． 注：保密学位论文(印涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文)在解密后适用于本授权书． 学位论文作者签名：_醢并砖 导师签名：名饧童_≮烈{}壹坷 签名日期：沙11 年‘月J El 签名日期：沙l f年／月／，日 源的ATP一柠檬酸裂解酶基因的克隆与表达目 源的ATP一柠檬酸裂解酶基因的克隆与表达 目 录 J H V●●2 1．2．1酵母菌和霉菌 ．．3 1．2．2藻类 3 1．2．3细菌 ．．3 1．3生物油脂代谢的途径和进展 4 1．4 ATP．柠檬酸裂解酶的作用机制 5 1．5 ATP．柠檬酸裂解酶的研究进展 6 1．6基因表达系统 ．． ．8 1．6．1大肠杆菌表达系统 ．8 1．6．2酵母表达系统 ．9 1．7本课题研究意义 ．1 O 第二章不同真菌来源acl基因的克隆 1l 2．1前言 ．11 2．2实验材料 ．11 2．2．1主要仪器设备 ll 2．2．2菌株和质粒 。： 12 2．2．3主要试剂 ．12 2．2．4主要试剂溶液的配制 。12 2．2．4．1培养基及相关试剂 ．．12 2．2．4．2琼脂糖凝胶电泳相关试剂 ．13 2．2．4．3质粒提取及相关溶液 l 3 2．2．5所需引物 ．．14 2．3实验方法 ．1 5 2．3．1粘红酵母和斯达酵母中acl基因的克隆 15 2．3．1．1 DNA和RNA的提取 ．1 5 2．3．1．2简并引物的设计 15 2．3．1．3 acl基因保守区的扩增 15 华中农业大学2011届硕士研究生学位论文2．3．1．4大肠杆菌E．coil 华中农业大学2011届硕士研究生学位论文 2．3．1．4大肠杆菌E．coil DH50t感受态的制备 2．3．1．5转化 ． 2．3．1．6阳性克隆子的筛选 。 2．3．1．7基因组步移法扩增acl基因全长 2．3．1．8 ImPCR扩增acl基因全长 ： 20 2．3．2高山被孢霉、米曲霉和核盘菌acl基因的克隆 20 2．3．2．1 DNA的提取 20 2．3．2．2引物设计 20 2．3．2．3 acl基因的扩增 20 2．3．2．4序列测序 23 2．4实验结果 一23 2．4．1 DNA和RNA的提取 23 2．4．2粘红酵母和斯达酵母acl基因的克隆 ．24 2．4．2．1 acl基因保守区的扩增 ．．． 24 2．4．2．2基因组步移法扩增结果 ．25 2．4．2．3 RT-PCR扩增结果 ■ ．： ．．27 2．4．2．4序列分析 ．．28 2．4．3高山被孢霉、米曲霉和核盘菌acl基因的克隆 31 2．5讨论 ．32 2．5．1真菌DNA的提取 32 2．5．2利用CODEHOP方法设计简并引物 一32 2．5．3 acl基因序列的分析 。33 2．6本章小结 ．．33 第三章不同真菌来源acl基因在大肠杆菌中的表达 35 3．1前言 35 3．2实验材料 ．．35 3．2．1主要仪器设备 35 3．2．2菌株和质粒 ．： 36 3．2．3主要试剂 36 3．2．4主要试剂溶液的配制 36 3．2．4．1蛋白纯化缓冲液 36 3．2．4．2Iris—cine系统电泳缓冲液 ．．37 3．2．4．3脂肪酸分析试剂 ．37 3．2．5所需引物 38 3．3实验方法 38 不同真菌来源的ATP．柠檬酸裂解酶基因的克隆与表达3．3．1不同真菌来源口d基因在大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)qb的表达 不同真