毒蕈碱受体在人角膜缘和角膜结膜表达的研究眼科学专业论文.docxVIP

Y Y 61803 7 菱舅蕉受垡壅丛虚攫釜塑堂生盘蕴堕杰垫丝翌窒 毒蕈碱受体在人角膜缘和角膜、结膜表达的研究 眼科学博士研究生：刘绍辉 导 师：王传富教授 Assoc．Prof．Donald Tan Prof．Roger Beuerman 摘 要 目 的：研究人角膜缘和角膜、结膜是否表达毒蕈碱受体卜5亚型(ml一5)。 材料与方法： 从人角膜缘组织分离上皮细胞并培养至第l一2代。RT-PCR分析培养人角膜 缘上皮细胞中角蛋白3、12 mlLNA的表达。免疫荧光染色研究增殖细胞核抗原 (PCNA)、p63和角膜上皮分化标志一角蛋白3、12(K3、K12)、外皮蛋白、连接蛋 白43在培养人角膜缘上皮细胞中的表达。用植块法培养角膜基质成纤维细胞。从 培养的角膜缘上皮细胞和角膜基质成纤维细胞中提取总RNA和蛋白质，行毒蕈碱 受体卜5亚型RT—PCR和Western Blot。免疫荧光染色研究m卜5在人角膜缘和角 膜组织和培养细胞的分布。 从人结膜组织分离上皮细胞和成纤维细胞并培养至第1．2代，提取培养细胞 的总RNA和蛋白质，行毒蕈碱受体卜5亚型RT—PCR和Western Blot。免疫荧光 染色研究m卜5在人结膜组织和培养细胞的分布。Brdu酶联免疫吸附试验检测毒蕈 碱受体激动剂carbachol对结膜成纤维细胞增殖的影响。 结果： 人角膜缘上皮细胞在丝裂霉素C处理韵3T3饲养层细胞上形成边界清楚的 克隆。培养细胞中K3和K12 mPdqA的水平明显低于上皮组织中的水平。培养细胞 的多数克隆不表达I(3、K12、外皮蛋白，仅少数克隆表层1．2个细胞呈阳性表达。 所有细胞PCNA染色阳性。p63在克隆基底层细胞呈强阳性，在K3阳性的表层细 胞中呈弱阻性。连接蛋白43在少数克隆中呈阳性表达。暴露于气液面后，培养的 角膜缘上皮细胞形成3-5层结构，外皮蛋白在外层细胞表达阳性，连接蛋白43在 基底层的细胞中表达，而K3阳性的细胞很稀疏。 培养人角膜缘上皮细胞和角膜基质成纤维细胞中存在编码毒蕈碱受体1-5亚 型的mRNA。Western blot在培养人角膜缘上皮细胞和角膜基质成纤维细胞中发现 m1．5的免疫反应带，各自的分子量大小约为ml 55kD；m2 55kD：m3 65kD；m4 毒荤碱受体在人角膜缘和角膜、结骥表达魄研究55kD：m5 毒荤碱受体在人角膜缘和角膜、结骥表达魄研究 55kD：m5 60kD。免疫荧光染色表明毒荤碱受体卜5亚型在培养人角结膜上皮细胞 和基质成纤维细胞中呈阳性表达，主要分布在细胞膜和细胞浆中。人角膜缘和角膜 组织上皮层、虎皮细胞层表达毒蕈碱受体卜5亚型。 RT-PCR结果表明编码毒蕈碱受体卜5亚型的mRNA存在于培养人结膜上皮细 胞和成纤维细胞中。Western blot在培养人结膜上皮细胞和成纤维细胞中发现m1． 5的免疫反应带。免疫荧光染色表明毒蕈碱受体卜5亚型在培养人结膜上皮细胞和 成纤维细胞中呈阳性表达。人结膜组织上皮层包括杯状细胞表达毒蕈碱受体1-5亚 型。毒蕈碱受体激动剂carbachol促进结膜成纤维细胞的增殖。 结论：人角膜缘上皮细胞在丝裂霉素c处理的3T3饲养层和SHEM的培养 环境下表现出类似角膜缘上皮层基底细胞的特点。毒蕈碱受体l_5亚型广泛存在于 角膜缘和角膜、结膜中，毒蕈碱受体激动剂carbachol促进结膜成纤维细胞的增 殖，提示该G蛋白受体对细胞功能有调节作用。 关键词：毒蕈碱受体；角膜缘；角膜；结膜 2 Expression Expression of Muscarinie Receptors Human Limbus，Cornea and Conjunctiva ABSTRACT Purpose：To characterize in human limbus，cornea and conjuncfiva the expression of muscarinic receptors(ml一5)． Materials and Methods： Epithelial cells疗om human limbus were isolated and cultured passage 1 2， Confluent cells were airlifted form multiple layers．The expression of PCNA．p63 and corneal epithelial differentiation markers cytokeratin 3(K3)，cytokeratin 12(K12)， inVolucrin，connexin 43(Cx43)，were studied cultured limbal epitheli