毕赤酵母表达重组羟基化人源明胶的研究生物化工专业论文.docxVIP

哪Y 哪Y iiii●lI 舢8 Ⅲ7 ㈣8 哪2川6 ㈣5 学位论文数据集 中图分类号 Q812 学科分类号 180．7110 论文编号 1001 020110124 密 级 公开 学位授予单位代码 10010 学位授予单位名称 北京化工大学 作者姓名 段慧明 学 号 2005080124 获学位专业名称 生物化工 获学位专业代码 081703 课题来源 自选 研究方向 分子生物学 毕赤酵母表达重组羟基化人源明胶的研究 论文题目 关键词 毕赤酵母重组明胶脯氨酸羟化酶羟基化共表达表征 论文答辩日期 2011．06．02 ·论文类型 应用研究 学位论文评阅及答辩委员会情况 姓名 职称 工作单位 学科专长 指导教师 陈劲春 教授 北京化工大学 基因重组 评阅人1 夺广涛 教授 清华大学 有机化学 评阅人2 黄迎春 教授 北京联合大学 生物工程 评阅人3 黄正明 教授 解放军302医院 药学 评阅人4 王台 研究员 中科院植物所 分子生物学 评阅人5 戴荣继 教授 北京理工大学 药物化学 徽员会拂 聋广涛 教授 清华大学 有机化学 答辩委员1 黄正明 教授 解放军302医院 药学 答辩委员2 王台 研究员 中科院植物所 分子生物学 答辩委员3 马润字 教授 北京化工大学 生化工程 答辩委员4 陈晓农 教授 北京化工大学 高分子材料 答辩委员5 注：一．论文类型：1．基础研究2．应用研究3．开发研究4．其它 二．中图分类号在《中国图书资料分类法》查询。 三．学科分类号在中华人民共和国国家标准(GB／T 13745-9)《学科分类与代码》中查询． 四．论文编号由单位代码和年份及学号的后四位组成。 L__-______～ L__-______～ 摘要毕赤酵母表达重组羟基化人源明胶的研究 摘要 毕赤酵母表达重组羟基化人源明胶的研究 摘要 明胶是胶原的热变性和不可逆的化学降解产物，按用途不同可 分为照相明胶、药用明胶、食用明胶和工业明胶，作为配料剂、悬浮 剂、粘合剂、成型剂等广泛应用于各领域。传统意义上的商品化明胶 作为一种屠宰场的副产品，主要通过物理化学方法提取，源于各种品 种、来源和年龄的动物(每一批都不同)，经过前处理后，明胶在一 系列条件下序列是变化的。这样不同生产批次的明胶不相同并且具有 不同的特性，再加上提取出来的明胶具有病毒和朊病毒的潜在污染的 风险，难以完全保证其产品安全性，而重组DNA是获得明胶的另一种 策略，这种策略通过表达具有特定长度和组成的胶原基因片段直接产 生明胶，能够提供具有稳定的和可预测的特性以及具有确切分子组成 的明胶。目前重组明胶由于没有引入外源脯氨酸羟化酶基因，因此都 未能发生羟化，即使有的物种具有内源羟化能力，但羟化程度较低， 从而不能形成坚固的三螺旋结构，在细胞内很容易降解，以至于不能 较快地分泌到细胞外。 本论文通过引入外源脯氨酸羟化酶基因，构建多基因(明胶基 因、脯氨酸羟化酶基因)共表达载体实现了在毕赤酵母中重组羟基化 北京化工大学博士学位论文 北京化工大学博士学位论文 明胶的表达，并且获得了一定羟基化比例的明胶。在构建的载体中， 三个独立 表达盒串联在一起，每一个表达盒都有自己的启动子和终止子， 分别转录出各自的mRNA并翻译出不同的蛋白，同时在每一个表达盒 中，我们选用了毕赤酵母的两种强诱导型启动子(PAOXI和PFLDl) 分别作为这些基因的启动子元件。主要工作有以下几个方面： 1．通过重叠延伸PCR方法合成了一段长约300bp的编码i00个 氨基酸(第531-630)的人I型胶原蛋白alpha(1)链明胶基因 (Genebank登录号：P02452)； 2．成功克隆了构成表达盒中的各个元件，其中PFLDl启动子元 件是以毕赤酵母基因组为模板扩增获得，同时用绿色荧光蛋白的表达 检测了启动子的功能，Q MF信号肽和TT(终止子)元件都是以表达 载体pPIC9K直接作为模板分别扩增获得，脯氨酸羟化酶基因(Q P4H 和B)分别是以含有各自编码基因的cDNA克隆为模板扩增获得； 3．重点构建了多基因表达载体，将明胶基因以及脯氨酸羟化酶 基因(Q P4H和B)同时引入到同一个毕赤酵母表达载体pPIC9K上。 首先获得含有各元件的T一载体，然后通过酶切连接方法将相邻的两 个含有元件的T一载体依次连接组装在同一个pGEM—T载体上，最后将 整个表达框从T载体上切下后移入到表达载体pPIC9K上； 摘要4．表达载体用S81 摘要 4．表达载体用S81 I线性化后，经电转化通过基因同源交换， 整个表达框被整合到毕赤酵母KM71染色体中，长出的转化子都是甲 醇利用慢型，用含有4mg／L G418的MD平板筛选后获得高拷贝菌株， 经过甲醇诱导后，目的蛋白具有较