槟榔碱对上皮细胞周期凋亡恶性转化影响的初步研究耳鼻咽喉科学专业论文.docxVIP

舢『IffI㈣川『||I|『『lJ|Ⅷ删删舢Y1 舢『IffI㈣川『||I|『『lJ|Ⅷ删删舢 Y1 9 1 82 1 5 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在在论文中作了明确的说 明。 作者签名：』 日期： 圣坐年—旦月—生日 学位论文版权使用授权书 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位 论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论 文；学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。 日期：』尘年兰月兰日 ———————————————] ———————————————] 摘 摘 要 背景与目的 口腔黏膜下纤维性变(oral submucous fibrosis，OSF)是一种 慢性、隐匿性且具有癌变潜能的口腔黏膜疾病。OSF癌变率高达7．6％。 咀嚼槟榔是OSF病变及癌变的主要原因，槟榔已被国际癌症研究中心 认定为I级致癌物。临床上多数OSF患者口腔黏膜上皮萎缩，胶原堆积， 仅少数患者上皮组织出现增生，在OSF癌变的组织中既有上皮萎缩又 有上皮组织增生或两者并存。研究还发现OSF及癌变组织中细胞周期 和凋亡相关蛋白表达异常。槟榔碱是槟榔的主要成份，槟榔碱在上皮 萎缩与上皮组织增生中起何种作用及其作用机制有待研究。 本研究以人永生化上皮细胞Hacat矛H人胚肺成纤维细胞Hel为模 型，首先观察短时间高剂量槟榔碱刺激下对这两种细胞存活率，细胞 周期和细胞凋亡的影响，初步探讨槟榔碱致上皮组织萎缩的分子机 制。进一步，研究长时间低浓度槟榔碱诱导下对上皮细胞Hacat细胞 周期、细胞迁移能力等恶性转化相关生物学特性改变的影响，为槟榔 碱致OSF上皮组织病变及其癌变的发病机制提供一定的理论依据。 方法 1．研究短时间高剂量槟榔碱刺激对上皮细胞Hacat和成纤维细胞Hel 的细胞毒性作用： MTT检测不同浓度(0，25，50，75，i00，125ug／m1) 槟榔碱对细胞存活率的影响；流式细胞术检测槟榔碱对细胞周期及凋 亡的影响；然后采用RT—PCR、Western blot检测细胞周期相关调控蛋 白的mRNA和蛋白表达水平的差异；Western blot检测细胞凋亡调节的 相关分子；琼脂糖凝胶电泳检测槟榔碱诱导下凋亡细胞DNA切割形成 的DNA Ladder：报告基因实验检测槟榔碱对CyclinDl启动子活性的影 响；CO-IP实验检测槟榔碱对Cycl inDl的泛素化调节。 2．检测低浓度槟榔碱长时间诱导下上皮细胞Hacat周期及迁移能力等 与细胞恶性转化及癌变相关生物学特性的改变：MTT检测低浓度槟榔 碱诱导不同时间对细胞存活率的影响；报告基因实验、Western blot 检测细胞周期蛋白CyclinDl的启动子活性和蛋白表达水平；Western blot检测姗P一9蛋白的表达，RNAi实验初步确定槟榔碱诱导下调控 MMP-9表达的转录因子：Transwell实验检测低浓度槟榔碱对上皮细胞Hacat运动能力的影响。 MMP-9表达的转录因子：Transwell实验检测低浓度槟榔碱对上皮细胞 Hacat运动能力的影响。 仕甲耋口木 1．MTT实验结果：50“g／m1及以上槟榔碱作用24h时明显抑制上皮细胞 Hacat的存活，呈浓度、时间依赖性(PO．05)；而100“g／ml及以上浓 度才影响成纤维细胞Hel的存活，且无时间依赖性。20pg／ml槟榔碱作 用2m，3m，4m，5m时促进上皮细胞Hacat存活(PO．05)。 2．流式细胞术结果显示：75，100，125“g／ml槟榔碱干预上皮细胞12 小时将周期阻滞于G1／S期，而对成纤维细胞Hel周期无明显影响；50， 75，100，125¨g／ml槟榔碱干预24tJ、时诱导上皮细胞Hacat凋亡Hacat 并呈剂量依赖性，随浓度升高，晚期凋亡细胞的比例也不断上升。 3．Western blot和RT—PCR表明：0，25，50，75，100，125肛g／ml槟榔 碱处理上皮细胞Hacat24h，抑制早G1期周期蛋白CyclinDl及CDK4的表 达；并促使晚Gl周期素依赖的蛋白激酶CDK2及E2F1的表达下调；而对 晚G1期细胞周期素CyclinA和Cycl inE表达稍有上调；对G2／M期演进调 控蛋白Cycl inB／CDC2表达影响不明显。 4．报告基因实验结果：50、75、100、125“g／ml槟榔碱作用24h显