samhd1蛋白的抗病毒功能研究动物学专业论文.docxVIP

北京协和医学院硕士学位论文摘 北京协和医学院硕士学位论文 摘 要 SAMHDI是近年来新发现的抗艾滋病毒的天然蛋白质分子，在髓系来源的树 突细胞、巨噬细胞和静息CD4+T细胞中，发挥dNTPase功能，通过降低胞内dNTP 水平，阻止HIV．1病毒早期复制。此外，HIV-2和一些SIV编码的Vpx蛋白，可以 通过加载SAMHDl到CRL4DcAFlE3泛素连接酶上诱导SAMHDl蛋白酶体降解，通 过降解SAMHDI促进HIV-I反转录产物eDNA的积累，明显促进人的单核细胞及 其来源的树突细胞和巨噬细胞的感染。本研究在前期研究的基础上，进一步探索了 恒河猴中不同SNP位点的SAMHDI蛋白的抗病毒功能、CEMxl74细胞中SAMHDl 蛋白表达与SIVmac239病毒水平的相关性以及SHIVsFl62P3感染恒河猴体内samhdl mRNA的变化等，以期进一步完善对SAMHDl蛋白抗病毒功能的认知。 第一部分：不同SNP位点的SAMHDl蛋白的抗病毒功能的研究。前期在中国 恒河猴中对SAMHDl蛋白进行了大样本筛查，共筛查出5个非同义cSNP位点，均 在群体中占有较高的频率。其中G183S、E184D、V280A分布在具磷酸水解酶活性 的HD结构域上；S107L分布在参与蛋白．蛋白或蛋白一RNA相互作用的SAM结构 域上。用软件对这5个SNP位点的SAMHDl二级、三级结构和功能影响进行了预 测分析。发现了其中G183S、E184D、V280A这三个位点最有可能影响蛋白质的功 能和结构，在二级结构上，这三个位点所处的HD结构域发生了一个Q螺旋到D片 层的转变，一个蛋白质结合位点也因为这三个cSNP的出现而发生了移位；在三级 结构上，V280A正好处于蛋白质活性中心(凹槽部位)的袋口处，类似于盒盖的结 构上，可能会影响到SAMHDl的磷酸水解酶催化活性。s j 07L位于SAMHDl敏感 性的位点，可能影响病毒Vpx蛋白结合，说明此位点也有较大可能会改变蛋白质的 功能。D5E未分布于重要的蛋白结构域上，目前还没有能改变蛋白功能的证据支持， 但也有文献报道，SAMHDI蛋白的N端能够与艾滋病毒相互作用，所以有待进一 步的实验验证。 本研究中，我们分别使用5种SNP位点突变的samhdl表达载体转染TZM．bl 细胞，再用转染后的细胞滴定HIV假病毒和SIV的病毒滴度，以验证5种SNP位 点突变的SAMHDl蛋白抗病毒功能的大小。结果表明，不同SNP位点的SAMHDI 蛋白的抗HIV病毒作用确实有些不同。其中，D5E、G183S、V280A三个位点突 变的samhdl质粒转染后与对照标准的samhdl质粒转染后的的病毒滴定结果一致； S107L位点的突变使得TCID50的值比对照降低了10倍，发挥了比其他5个位点突 变更高的抗病毒作用；E184D位点的突变，测出的TCID50的值比对照TZM．bl细胞 的值高，说明转染进入细胞的基因可能没有发挥抗病毒功能反而还影响了正常细胞 内的抗病毒蛋白发挥作用。与之相反，分别用转染六种不同samhdl基因的TZM．bi 细胞滴定SIVmac239病毒得到的TCID50的值都是一样的。说明不同SNP的 4 万方数据 北京协和医学院硕士学位论文SAMHDl蛋白抗SIVmac239的作用差异较小，对病毒的最终滴度影响不大。这应 北京协和医学院硕士学位论文 SAMHDl蛋白抗SIVmac239的作用差异较小，对病毒的最终滴度影响不大。这应 该与SIVmac239编码的Vpx蛋白有关。这也说明，由于SIV病毒中Vpx蛋白的存 在，SIV感染恒河猴不同个体问出现的疾病进程的差异应该与恒河猴体内的 SAMHDl蛋白没有太大关系，更与SAMHDl蛋白的不同的SNP位点无关。 第二部分：CEMxl74细胞中SAMHDI蛋白表达与SlVmac239病毒水平的相 关性研究。SAMHDI蛋白作为限制因子，在髓系树突细胞、巨噬细胞和静息CD4+T 细胞中，发挥dNTPase功能，通过降低胞内dNTP水平，阻止HIV-1病毒早期复制， 但在感染的活化CD4+T细胞中，是否发挥抗病毒作用却知之甚少。 本研究中，CEMxl74细胞感染SIVmac239病毒后，随着培养上清中的病毒载量 快速升高，细胞中病毒P27蛋白的表达水平也增加迅速。而samhdl的mRNA相对 表达量在4天后显著增加，与病毒载量呈正相关，可见细胞在感染过程中，上调了 samhdl基因的表达；与之相反的是细胞中SAMHDI蛋白表达量从4天后逐渐下降， 第5-6天时基本检测不到，与SIV病毒P27蛋白量呈显著负相关。SAMHDI蛋白表 达量的降低，可能与SIVmac239病毒产生的Vpx蛋白降解SAMHDl蛋白有关。 SAMHDI蛋白在活化的细胞中是否发挥抗病