副粘病毒tianjin株全基因组测序及生物信息学分析病原生物学专业论文.docxVIP

摘 摘 要 副粘病毒为有包膜的负链RNA病毒，是一类重要的人类和动物致病病毒， 如尼帕病毒(Nipah virus)、亨德拉病毒(Hendra virus)、Menangle病毒等。1999 年我们从因呼吸道感染而死亡的灵长类动物狨猴肺组织中分离到一株病毒，经 过一系列研究初步证实该病毒可能是一株副粘病毒，暂时命名为副粘病毒TiaIliin 株。在病原鉴定过程中，我们曾经通过RT-PCR方法扩增得到该毒株一段长为 375 bp的片段，并将测序结果发送到互联网BLAST服务器进行联配检索，发现 其与仙台病毒HN基因同源性较高，但推导出的氨基酸序列还存在较大差异。更 重要的是，仙台病毒是啮齿类动物致死性病原体，然而在普通棉耳狨猴呼吸道 疾病流行期间，饲养在同一实验中心的各种实验用鼠无一例发病。而且血清学 调查结果显示，动物中心工作人员都有此病毒的抗体；正常人群中对此病毒的 抗体阳性率高达35％；患急性呼吸道感染的儿童抗体阳性率为19．28％，说明此 病毒与人类关系密切，可能是仙台病毒发生了某些变异而跨越了种属界限，形 成对啮齿类动物低致病性，而对灵长类动物乃至人类高致病性的毒株；或者是 一株未被发现的能引起灵长类动物及人类呼吸道感染的新的副粘病毒。为进一 步明确其来源和种系进化地位，阐明与人类疾病间的关系，我们从分子水平上 对该病毒进行了较为深入的研究。 首先，在第一部分工作中，我们在引物步移测序策略指导下对副粘病毒 Tianjin株全基因组进行了测序。根据GenBank中已发表的仙台病毒全基因组序 列，设计了13对引物，以鸡胚尿囊液中提取出的病毒总RNA为模板，扩增得 到13个覆盖整个基因组的相互重叠片断，同时采用3’RACE和5’RACE法对 Tianjin株基因组末端序列进行扩增，经克隆、测序、拼接，最后得到了Tianjin 株的全基因组序列。结果表明，副粘病毒Tianjin株基因组由15，384个核苷酸组 成，与已知仙台病毒基因组长度完全相同，遵循“六碱基原则”。从基因组的3’ 端至5’端依次排列着3’UTR，结构基因NP、P、M、F、HN和L编码区，以及 5’UTR。P基因内同样包含了另外一重叠的开放阅读框，且存在着一个保守的 RNA编辑位点(RNA editing site)3-UUUUUCCC．5’。推测除了编码NP、P、 M、F、HN和L六种病毒特异性结构蛋白外，另外还可能编码C、v、w等非 M、F、HN和L六种病毒特异性结构蛋白外，另外还可能编码C、v、w等非 结构蛋白。Tianjin株各结构基因的上下游均存在着保守的基因起始信号S和终 止信号E，连接E和S的是一个保守的三核苷酸间隔区GAA或GGG。但是与 已知仙台病毒相比，Tianjin株基因组结构中有两处明显不同，一是在HN基因 和L基因间保守的s序列中有一个碱基发生突变(A8532G)：二是L基因终止 密码子突变(A15240C)，导致预测的TianjiIl株L蛋白比已知仙台病毒L蛋白 多了一个氨基酸。比较巧合的是，仙台病毒BBI株也在该点出现同样的突变。 这些突变有可能导致TianjiIl株出现一些独特的生物学特性。 在本文第二部分工作中，我们对测序得到的Ti删m株全基因组序列进行了 较为全面的生物信息学分析。为了确定Ti删ill株在副粘病毒科中的分类地位， 我们将TianjiIl株与副粘病毒科25株病毒全基因组序列进行了系统进化分析，进 化树显示，Tianjin株与仙台病毒、人副流感病毒1型、人副流感病毒3型和牛 副流感病毒3型位于同一个分支，且与仙台病毒亲缘关系最接近，说明Tianiin 株在分类上属于副粘病毒科副粘病毒亚科呼吸道病毒属。进一步与GenBank中 14株仙台病毒全基因组序列比较，进化树显示，Tianjin株不属于现有的三个分 支，而是独立为一个分支，同源性分析同样支持这一结果，因此Tianiin株应被 列为仙台病毒第四种基因型。 另外，结构基因推导出的氨基酸序列同源性比较显示，P蛋白变异最大，虽 然只有568 aa，却含有29个独特变异位点和35个与BBI共同具有的变异位点， 与已知仙台病毒同源性仅为78．7％～91．9％。比较其他仙台病毒，也具有这样的特 点，说明P蛋白有可能是仙台病毒的特异性抗原。六个蛋白中，同源性最高的 是L蛋白，为96．00／一98．0％，其次是M蛋白，为93．1％～97．1％，说明二者较保 守。氨基酸序列进化树分析显示，六种结构蛋白的进化树与基因组序列的进化 树基本一致，仅有细微的不同，其中变化较大的是M蛋白。在M蛋白进化树中， Tianjin株与Ohita株和Hamamatsu株代表的分支最接近，同源性也最高，为 97．1％，与BBl株同源性为96．6％。而在其他蛋白进化树中，Tialliin株均