产乙醇菌株的选育及木糖代谢关键酶基因的克隆微生物学专业论文.docxVIP

厦 门大 厦 门大学 硕士学位 论文 产 乙醇菌株 的选 育及木糖代 谢关键 酶基 因 的克 隆 摘 要 生 物 乙醇 作 为 一 种 清 洁 可 再 生 能 源 ，被 纳 入 许 多 国家 的 能 源 发 展 规 划 。廉 价 的 原 料 和 高 效 转 化 工 艺 是 燃 料 乙醇 商 业 化 生 产 的 必 要 条 件 ，利 用 可 再 生 植 物 纤 维 资 源 生 物 转 化 制 取 乙醇 的研 究 成 为 当 前 的热 点 ，尤 其 是 利 用 纤 维 素 生 产 燃 料 乙 醇 ，而 纤 维 素 糖 化 液 的 高 效 转 化 和 木 糖 转 化 成 乙醇 是 关 键 因 素 之 一 。其 中木 糖 的 高 效 乙醇 发 酵 是 该 技 术 工 业 化 的基 础 和 制 约 因 素 。寻 求 性 能 优 良的 木 糖 发 酵 菌 株 和 研 究微 生物 木 糖 代 谢 工 程 成 为 当前研 发 的重 点 。 本 研 究 从 酒 曲和 牛 粪 样 品 中 分 别 筛 选 到 一 个 发 酵 蔗 渣 糖 化 液 产 乙 醇 的 菌 株 和 一 个 发 酵 木 糖 产 乙醇 的 菌 株 。经 形 态 学 分 析 、理 化 特 性 鉴 定 和 分 子 生 物 学 鉴 定 ， 确 定 这 两 个 菌 株 分 别 属 于 酿 酒 酵 母 属 (命 名 为 sa ccharo 阴lyces cerevisiao Q Z一l) 和 热 带 假 丝 酵 母 属 (命 名 为 Ca ndida t九少icalis H 一1 )。 对 s. 。erevisiao Q Z 一1 发 酵 蔗 渣 糖 化 液 产 乙醇 的条 件 进 行 研 究 。通 过 对 发 酵 条 件 的 优 化 ， 该 菌 株 在 起 始 PH 值 为 5 . 5 ， 温 度 为 30 ℃ 的 条 件 下 ， 利 用 含 有 0 .4% 硫 酸 按 的 发 酵 培 养 基 静 置 发 酵 60h ， 发 酵 率 可 以达 到 89 . 18% ， 19 蔗 渣 可 以转 化 成 0 . 136 9 乙醇 。 提 取 Ca ndida t代少ica lis H 一1 总 DN A ，设 计 引 物 ，通 过 基 因 克 隆 ，从 C l汽少ica lis H 一1 的 总 DNA 上 克 隆 到 木 糖 还 原 酶 基 因 (咧 I) 和 木 糖 醇 脱 氢 酶 基 因 (划 22 )，分 析 这 两 个 基 因 的 序 列 ，没 有 内含 子 。将 基 因 咧 I 和 咧 2 插 入 pP IC 3 .SK ， 构 建 了 整 合 载 体 p PI C3 . SK刃 11刃 口，电转 化 至 尸ich ia stiP itis GS lls 中 。咧 1 和 砂 12 通 过 同 源 臂 交 换 整 合 至 G S 1 15 染 色 体 上 ， 通 过 菌 落 PC R 筛 选 ， 获 得 了 重 组 子 G S l l 5 刃 11 刃 12 。 木 糖 还 原 酶 (X R) 是 NA D (P) H 依 赖 性 氧 化 还 原 酶 ，以 NA DPH 或 NA DH 为 辅 酶 ， 木 糖 醇 脱 氢 酶 (XDH ) 以 NA D+ 为 专 一 辅 酶 。用 甲醇 诱 导 重 组 子 表 达 ，通 过 细 胞 破 碎 ， 收 集 粗 酶 液 。测 得 粗 酶 液 中 XR 和 X DH 的 相 对 酶 活 分 别 为 12 .3U 和 1. IU ，重 组 蛋 白 X R 对 辅 酶 N A D PH 的 依 赖 性 要 比对 辅 酶 NA DH 的 依 赖 性 大 ， 表 明 该 酶 可 能 为 NA D PH 的 依 赖 型 。 蛋 白酶 X D H 的 活 性 相 对 比较 高 ，达 到 2 2 32 .g U 。 关 键 词 : 酿 酒 酵 母 Q Z一1; 热 带 假 丝 酵 母 H 一1 ; 木 糖 还 原 酶 ; 木 糖 醇 脱 氢 酶 厦门大学硕士学位论文 产乙醇菌株的选育及木糖代谢关键酶基因的克隆 2 厦 门大 厦 门大 学 硕 士 学 位 论 文 产 乙醇 菌 株 的选 育 及 木 糖 代 谢 关 键 酶 基 因 的 克 隆 A b s t r a e t B io e than o l 15 tak e n into ac e o un t as m an y e o u n trie s ，stra te g y a s a su stain ab le ， P o rtab le an d ren e w a b le e n e rg y so ur