产βmannanase内生菌的诱变育种和酶学特性研究微生物学专业论文.docxVIP

摘要夕-甘露聚糖酶(fl-mannanase)又叫J3．1，4．D．甘露聚糖酶(夕-1，4-D-mannarl 摘要 夕-甘露聚糖酶(fl-mannanase)又叫J3．1，4．D．甘露聚糖酶(夕-1，4-D-mannarl mannanohydrolase，EC 3．2．1．78)，是一种半纤维素酶，能够随机水解少．1，4．甘露糖苷键的 较了紫外线诱变，硫酸二乙酯诱变，紫外线一光复活诱变以及紫外线一硫酸二乙酯复合诱 变，确定最佳诱变方案为紫外线一硫酸二乙酯复合诱变：先用20W紫外灯于30 cm出照 射6 min，再用1．6％的硫酸二乙酯处理40 min。获得一株高产突变菌株Bacillus subtilis UD一20，发酵酶活达89．5 U／ml，比出发菌株提高了63．9％，传代7次其遗传性能稳定， 命名为Bacillus subtilis UD．20。 通过对Bacillus subtilis UD一20的发酵培养基和发酵条件优化，确定最佳产酶条件为： 魔芋精粉30 g／L，蛋白胨3∥L，硝酸铵3 g／L，氯化钙3．0 mmol／L，氯化镁2．0 mmol／L，氯化钡0．2 mmol／L，吐温80 1．0∥L，甘氨酸0．2 g／L(于发酵进行lOh左右向 发酵培养基中添加)，2％的接种量，pH 7．0，35℃，180 r／min发酵培养72 h，DNS法 测得酶活最高为213．6 U／ml。在此基础上进行摇瓶补料发酵，酶活高达275．1 U／ml，较 未补料酶活提高了34％，是出发菌株的5．0倍，另外，静置培养酶活也比常规发酵提高 了24．5％。 居一甘露聚糖酶酶学特性分析显示，该酶的最适温度和pH分别为50V和7．0，该酶 在50℃以下，pH 5．0．8．0之间稳定性较好。2．0 mmol／L的钙、镁、铁、钴离子和0．2 mmol／L 的钾、钙、铜、镍离子对酶有激活作用，其中以2．0 mmol／L的铁和钴离子的激活作用最 强，相对酶活分别提高了13．2％和31．7％，但是2 mmol／L的锰离子对酶活有极强的抑 制作用，酶活仅有对照组的55．6％；2．0 mmol／L的钾、钙、镍、钻、钡离子和0．2 mmol／L 的镍离子能够增强酶热稳定性，其中以2．0mmol／L的钴离子的增强效果最为明显，残余 酶活是对照组的1．48倍，但是在2．0 mmol／L的锰离子作用下，残余酶活力仅有对照组 V 的59．4％。届．甘露聚糖酶对葡甘露聚糖、瓜尔豆胶和槐豆胶的Km和Vmax值分别为10．9、15．6、 的59．4％。 届．甘露聚糖酶对葡甘露聚糖、瓜尔豆胶和槐豆胶的Km和Vmax值分别为10．9、15．6、 33．4 mg／ml和9960．2、526．3、769．2 U／ml，较低的Km和较高的V一显示少-甘露聚糖酶 的最适反应底物为葡甘露聚糖，酶解葡甘露聚糖的酶活为6116．6 U／ml，是酶解槐豆胶的 22．2倍，酶解瓜尔豆胶的28．2倍，酶解槐豆胶为甘露寡糖，不含单糖。植物内生菌Bacillus subtilisUD．20所产的／3．甘露聚糖酶可以应用于食品、饲料、保健品等行业。 关键词：内生菌，少．甘露聚糖酶，葡甘露聚糖，静置培养，底物特异性， VI ABSTRACT少-mannanase(1,4妒-D-mannan ABSTRACT 少-mannanase(1,4妒-D-mannan mannanosidase，EC 3．2．1．78)is all endohydrolase，which randomly hydrolyzes ft一1，4一linkages of mannan-based polysaccharides，hydrolyzing mannan into mannose oligosaccharide or monosaccharide．Over the past decade，endo-b-1，4-mannanases have attracted worldwide researchers and played important role in paper and pulp industry,food and feed technology, spinning，bleaching，coffee extraction，oil drilling and detergent industry．Despite having high practical potentialities，however,in china，the of mannanase is still limited due to low yields and high-production costs，the study of ft