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第三章：香菇种质资源的SRAP分析 1材料与方法 1.1供试菌株 为本实验宗保存菌种，香菇品种名录见第二章表2. 1。 1.2.1试管斜面培养基 PDA培养基200g马铃薯、20g葡萄糖、20g琼脂、lOOOmL水。 1.2.2液体PDA培养基 PDA培养基200g马铃薯、20g衙萄糖、1000汕水。 1.3试剂仪器 SNAP引物为上海博亚生物技术有限公司产品，如下图表3. l;MgCl2和脱氧核苛三磷酸 (dNTP, 2. 5mM each) Taq DNA 聚合酶(5U/?1)为 TaKaRa 产品。 紫外可见分光光度计:Pharmacia Biotech ultrospec2000 电泳仪：D-YY-12型电脑三恒多用电泳仪(北京六一仪器厂) 凝胶成像系统：TAN0N-2008 冷冻离心机:Sigma 3K30 PCR 扩增仪:Eppendorf AG22331 Hamburg 冷冻离心机:Sigma 3K30 掌型离心机：江苏海门市麒麟医用仪器厂Lx-100手掌型离心机 表3.1 SRAP引物序列 Table3.1 Nucleotide sequenee of Sequence-related Amplified Polymophism 上游引物 Upstream primer 下游引物 Downstream primers 编号 碱基序列 编号 碱基序列 Mel TGAGTCCMACCGGATA Eml GACTGCGTACGAATTAAT Me2 TGAGTCCAAACCGGAGC Em2 GACTGCGTACGMTTTGC Me3 TGAGTCCAAACCGGAAT Em3 TGAGTCCAAACCGGAGC Me4 TGAGTCCMACCGGAGC Em4 TGAGTCCMACCGGAGC Me5 TGAGTCCMACCGGAGC Em5 TGAGTCCMACCGGAGC Me6 TGAGTCCAAACCGGTAG Em6 GACTGCGTACGMTTGCA Me7 TGAGTCCAAACCGGTTG Em7 GACTGCGTACGAATTATG Me8 TGAGTCCMACCGGTGT Em8 GACTGCGTACGMTTAGC Me9 TGAGTCCAAACCGGAGC Em8 TGAGTCCAAACCGGAGC Em9 GACTGCGTACGAATTACG EmlO GACTGCGTACGAATTTAG Emil GACTGCGTACGAATTTCG Eml 2 GACTGCGTACGAATTGTC Eml 3 GACTGCGTACGAATTGGT Eml4 GACTGCGTACGAATTCAG Eml 5 GACTGCGTACGAATTCTG Eml 6 GACTGCGTACGAATTCGG Eml 7 GACTGCGTACGMTTCCA 1. 4菌丝培养 将40个香菇冰箱保种菌种接于试管斜而培养基，转管活化7-10天，用接种耙耙碎后， 接入250ml三角瓶液体培养基中，每个菌株各接3瓶，于25°C摇床上120 rpm培养10天， 用400目铜网过滤，蒸饰水冲洗，滤纸吸干，保存于一20°C备用。 1.5 DNA提取方法 同第二章1.5.2 CTAB法 1.6香菇基因组DNA电泳检测 取5 u 1DNA加1 U16X漠酚蓝，在0.8%琼脂糖凝胶(含0.5 Ug/mlEB)上电泳,4V/cm 电压电泳约1.5h,在凝胶成像仪上照相。 7香菇基因组SRAP-PCR扩增条件优化 SRAP分析在香菇上的应用还没有看见过报道，为探索出适于香菇SRAP扩增反应的最 优体系，比较DNA模板、dNTP,随机引物浓度以及Taq酶川量对RAPD扩增的影响，寻找最优 化条件。 对扩增反应25 HL体系的各因子设置了如下梯度：模板DNA用量设置10、15、20、25、30、35、 40、45、50ng共9个梯度;随机引物设置2.5umol/L, 5 u mol/L, 7.5 u mol/L,10u mol/L, 12.5 u mol/L, 15umol/L, 17.5 U mol/L,20U mol/L共8个梯度;dNTP浓度设50umol/L, lOOumol/L, 150 Hmol/L, 200 H mol/L, 250nmol/L, 300nmol/L共6个梯度；Mg2+浓度设置 1. 5mmol, 2.0mmol, 2.5mmol, 3.0mmol, 3.5mmol, 4.0mmol共6个梯度；TaqDNA聚合酶设置0.5U, 1.0U, 1.5U, 2.0U, 2.5U, 3.0U共6个梯度。 扩增反应体系包JS1UL模板,2.5uL10Xbuffer缓液，2.5mLMg2+(25mmol/L), 2. 5 u Ld