多价小鼠精子抗原表位肽的构建及其避孕效应研究泌尿外科妇产科专业论文.docxVIP

多价小鼠精子抗原表位肽的构建及其避孕效应研究摘 多价小鼠精子抗原表位肽的构建及其避孕效应研究 摘 要 f I以精子／睾丸抗原为靶抗原的免疫性避孕疫苗因可能适用于两性，一直受 到研究者的青睐。然而从上个世纪70年代至今，大量的报告并未得出令人满 意的结果：不是避孕效应低下，就是不良反应严重。其根本原因在于(1)精 子／睾丸抗原为自身蛋白，抗原性低下；(2)参与受精过程的分子众多，作用 尚未完全清楚。因此，解决这一难题的关键在于选择关键分子，增强抗原性。 精子与卵子透明带、卵子质膜的相互作用是受精过程的关键环节，也 是免疫性避孕研究的主要着眼点。配子中的许多分子均参与了上述关键环 节，如在精母细胞、精细胞和睾丸精子中表达，并特异性与卵子透明带糖 蛋白、葡聚糖、糖酐脂结合的精予表面蛋白17(SPl7)，以及参与识别或 与卵子膜上的整合素相互作用的ADAM家族成员之一的Cyritestin蛋白 等。其N端含有去整合素结构域，然而多数实验结果表聪单一应用这些分 子所获得的免疫性避孕效应非常有限，从而提出今后的研究方向是更具抗 原性或良好运载体系的新型多价疫苗。 将两种或更多的精子／睾丸特异性蛋白中起决定作用的关键表位加以 适当联合，获得多价的新抗原是本研究的主要创新之处。这样可通过多环 节作用于受精过程，达到提高避孕效应的目的。y本研究以堡自厦筮壬设计的 理论和方法研究避孕疫苗，将SPl7和Cyritestin关键表位和牛核糖核酸酶非 选择性nl细胞表位合理组合，获得新抗原一35肽序列；并在合成、纯化后分 别与弗氏佐剂、免疫刺激复合物(ISCOMs)混合后免疫不同遗传背景的雌性 小鼠，观察血清和生殖道内的特异性抗体滴度的动态变化、生育力的改变以 及免疫后小鼠重要脏器的组织病理学改变：以及在ⅣF下，新抗原的特异性 抗血清对精卵相互作用的影响及抗原在精子表面的特异性定位。 ／本研究的主要结果和结论如下： (一、经抗原分子设计，在430A自动肽合成仪上合成的新抗原P3，经 VIIl 质谱仪分析证明其荷质比与理论一致；纯化后，其纯度大于95％；将新抗 质谱仪分析证明其荷质比与理论一致；纯化后，其纯度大于95％；将新抗 原与KLH偶连后免疫小鼠，经Westem blot证实其诱导的特异性抗体可识 别小鼠、大鼠、人睾丸组织中分子量约为22KD和55KD左右的蛋白质。 二、P3多肽与弗氏佐剂混悬后免疫近交系Balb／C小鼠后，在血清和 阴道粘膜冲洗液中可检测出特异性IgG、IgA，最高效价分别达到1：6000 和1：300：免疫后的小鼠脾脏淋巴细胞增殖率升高，淋巴细胞培养上清液 中分泌的IL．4和INF—Y也升高，且以IL．4更明显。提示P3多肽可刺激小 鼠产生较强的机体全身免疫效应，并具有促进Th2型细胞极化的功能，有 利于机体的体液免疫应答。 三、P3多肽与弗氏佐剂混悬后分别免疫Balb／C和C5781／6小鼠，结 果Balb／C雌鼠妊娠率平均降至61．1％，每胎产仔数降至4．3只；C5781／6 雌鼠的妊娠率及每胎产仔量降低更为显著，分别为44．4％和4．1只。初步 证明以精子抗原表位肽为靶抗原的多肽疫苗P3具有显著的免疫性避孕效 应，且该作用可突破遗传限制。 四、免疫后小鼠的组织病理学观察未发现肝脏、脾脏、肾脏的病理改 变，卵巢的卵泡发育正常，睾丸内精子数量多，无明显的淋巴细胞浸润。 取免疫后小鼠及其分娩的子代鼠骨髓行微核实验，结果与正常小鼠相比， 实验组PCE，NcE和微核率无明显差别。 五、在ⅣF条件下，特异性P3抗血清可显著抑制小鼠精子与去透明带卵 子间的相互作用，包括精卵结合与融合；新抗原P3多肽主要定位于小鼠精予 的头部顶体膜区域；与抗血清孵育后的精子超微结构无明显改变。 六、将P3多肽与脂类、QuiA以一定比例混合后，成功地制备了新型 免疫刺激复合物ISCOMs，并在电镜下观察到明显的蜂巢样结构，多肽嵌 入率测定提示多肽含量为0．26mg／ml。多肽-ISCOMs复合物免疫C5781／6 小鼠后显示出强大的刺激效应：血清和阴道粘膜中的特异性抗体滴度迅速 升高，并持续较长时间；小鼠的受孕率显著减低至14．3％，3月后升至20％。 提示ISCOMs应用于避孕疫苗研究领域具有广阔的前景。y 关键词： 精子抗原合成肽 免疫性避孕表位疫苗佐剂 ＼／ V IX＼一7 o L， Synthesizing Synthesizing of Epitope Peptide corresponding to the Sperm Specific Antigens and Its Immunocontraceptive Effects Abstract In recent years，the researches indicate that the