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微流式细胞分析术技术研究 微流式细胞分析术(Personal Flow Cytometry)是采用微毛细管流式技 术(Microcapillary)对液流中形成单细胞流的细胞或其它生物微粒(如 人工微球，细菌，小型模式生物等)逐个进行绝对计数和快速定量分 析的技术。作为下一代的流式检测技术平台，微流式细胞仪诞生于上 世纪九十年代。经过近二十年的发展和完善，今天的流式细胞仪已经 接近成熟，并被广泛的运用于从基础研究到工业半产的各个方面，涵 盖了细胞生物学、免疫学、血液学、肿瘤学、药理学、遗传学及生物 能源等领域，在各学科中发挥着重要的作用。 微流式细胞术?微流式细胞分析术-概述 基于传统流式细胞术，微流式细胞分析术改进了其复杂的液流系统， 采用微毛细管技术提高上样效率，显著减少样品用量，摒弃了传统的 鞘液流方式。由于微毛细管设计，使每次实验仅需消耗1000-10000 个细胞/Testo精确的上样体积使得绝对细胞计数成为可能。 微毛细管技术：样品上样时，由微毛细管与样品液体接触的横截面中 心形成的负压区，形成单细胞流上行。注射泵提供稳定精确的上样流 与上样体积。由微毛细管和注射泵协同作用形成的单细胞流更加精确 与稳定。运行8小时只产生不到50ml的废液；允许检测样本最小上 样量仅为1000个细胞；同时无鞘液系统的液流系统成固定状态，仪 器操作简单，缩短学习时间，从而提高研究效率。 微流式细胞分析术具备如下特点： ＞稳定的单细胞流，进样过程完全摒弃了鞘液流 ＞样本需求少至1000 Cells/Test,支持低浓度样本检测10 Cells/U 1＞最低实验样本需求量10^1 微流式细胞术?微流式细胞分析术-简史 17世纪第一台显微镜诞生后，人们开始应用于细胞和组织切片的检 查，从此拉开了人类对细胞的科学研究的序幕。到了 19世纪末，人 们已经可以通过对细胞染色，在显微镜下对细胞的结构进行形态学的 研究。到了 20世纪40?50年代，由于技术的进步，出现了更先进和 更灵敏的荧光显微镜，再加上抗体技术的进展，荧光标记的抗体技术 被广泛应用。这一时期单克隆抗体技术的岀现，使得人们可以对细胞 的表面特异抗原进行识别。人们不仅可以从形态学上对细胞进行分 类，更可以根据细胞的特异标志进行细胞亚型的精确分类，以进行更 深入的研究。 1934年Andrew Moldaran实现了让悬浮的单个血红细胞通过玻璃毛 细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并在显微镜的目镜上用光电记 录装置对通过的每一个细胞进行计数测量。其后Louis Kamentsky及 Melamed等人又对这一技术进行了了的进一步改进。随着20世纪50 年代到80年代的发展，流式细胞术被广泛应用于细胞研究，并朝着 多参数分析的方向发展。 但随后的20多年里，该技术并无实质性改进。同时由于釆用了鞘液 流系统和复杂的光路系统，使得机器体积较大，并且加上复杂的软件 系统，机器日常使用很不方便，常需要专人对机器进行维护和使用， 这就大大限制了流式细胞术在普通实验室的应用。 直到1998年Phillipe Goix博士将最新的微毛细管技术引入流式细胞 仪，开创了流式细胞仪的革命性创新。2009年，改进的微毛细管液 流系统结合了最新的双激光同步共线性设计，使得机器体积大大减 小，再加上创新设计的智能化模块软件系统，让流式细胞术变得更为 简单。 微流式细胞术?微流式细胞术?原理 流式细胞术待测样品（如细胞、微生物、精子或细菌等）经荧光染料染 色后制成样品悬液，由微毛细管与样品液体接触的横截面中心形成的 负压区，形成单细胞流上行，排成单列的细胞成为单细胞液流，并与 入射激光束相交。细胞被激发而产生荧光，通过滤光片组合和光电倍 增管进行信号收集。 整个仪器用多道脉冲高度分析器处理荧光脉冲信号和光散射信号。测 定的结果用单参数直方图和双参数散点图来表示。 微流式细胞术?微流式细胞术?应用 免疫学检测 免疫系统是由免疫器官、免疫组织、免疫细胞及免疫分了组成。体内 的免疫细胞通常处于静止状态，细胞必须被活化，经免疫应答过程， 产生免疫效应细胞，释放免疫效应分子，才能执行免疫功能。免疫细 胞分为两类，一类是固有免疫应答细胞，如单核一巨嗜细胞，自然杀 伤细胞、多形核中性粒细胞等。另一类是适应性免疫应答细胞：即淋 巴细胞，包括T细胞及B细胞。检测各群体淋巴细胞的数量与功能是 观察机体免疫状态的重要手段。 图1,微流式细胞分析术对淋巴细胞亚群进行区分。图A：全血细胞 在FSC与SSC散点图中可分为淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。图B: CD45 High为淋巴细胞群。图C: CD45+CD3+为T淋巴细胞，CD45+CD3- 为非T淋巴细胞。图D: CD3+CD4+为T help细胞，CD3+CD8+为T cytotox