健脾化瘀方防治非小细胞肺癌的体内外实验研究-中医内科学专业论文.docxVIP

健脾化瘀方防治非小细胞肺癌的体内外实验研究 中 文 摘 要 目 的 ：观察健脾化瘀方对人肺癌细胞株 A549 增殖的抑制作用、凋 亡的作用及其对凋亡、炎症氧化应激相关基因的调节表达的影响；建立 对 C57BL/6 小鼠 Lewis 肺癌皮下移植瘤模型，并观察健脾化瘀方对移植 瘤生长曲线，移植瘤大小的影响及对 C57BL/6 小鼠免疫相关因素，脾指 数、胸腺指数的影响，及血清中炎症相关因子表达的影响。 方 法 ：（1）通过 MTT 法，观察不同浓度、不同时间健脾化瘀方 作用于人肺癌 A549 细胞和鼠肺癌 Lewis 细胞增殖的抑制作用。（2）通 过 Annexin-V/PI 双染色法，运用流式细胞仪检测研究不同浓度健脾化瘀 方对人肺癌细胞株 A549 凋亡的诱导作用。（3）通过荧光显微镜观察经 Hoechst33342 的核染色后健脾化瘀方对于人肺癌细胞 A549 作用后的细胞 凋亡形态变化，证实其凋亡的发生。（4）通过使用 Real-time PCR 方法 检测健脾化瘀方作用于 A549 细胞对凋亡相关基因 Survivin，Bcl-2， β-catenin、BAX 的 mRNA 表达的影响；炎症以及氧化应激相关基因 IL-1β、 TNF-α、Nrf2、HO-1、Twist 的 mRNA 表达的影响。（5）通过使用 Western Blotting 方法检测健脾化瘀方作用 A549 细胞后炎细胞因子 MCP-1，IL-6， TGF-β1，以及细胞粘附分子 ICAM-1 和核因子 NF-κB 蛋白表达的影响。 （6）通过建立 C57BL/6 小鼠 Lewis 肺癌皮下移植瘤模型，观察健脾化瘀 方对 C57BL/6 小鼠皮下移植瘤瘤体体积，瘤生长曲线的影响，荷瘤鼠的 胸腺指数，脾指数的影响。（7）运用 ELISA 检测对荷瘤小鼠血清中炎性 相关因子的表达的影响。 结果：体外实验中健脾化瘀方（1、2、4 mg/mL）能明显抑制 A549 细胞增殖并呈浓度依赖性，通过 Annexin V/PI 流式细胞仪和 Hoechst 33342 染色结果表明，健脾化瘀方能够诱导细胞凋亡，引起 A549 细胞核 变化使得细胞核固缩，DNA 和染色质缩合和碎裂。通过 Real-time PCR 方法检测健脾化瘀方作用于 A549 细胞诱导其凋亡的可能机制与下调 Survivin，Bcl-2，β-catenin；上调 BAX 基因的 mRNA 表达有关；能够下 调细胞中 IL-1β、TNF-α、Nrf2、HO-1、Twist 炎症以及氧化应激相关基 因的 mRNA 表达。通过 Western blotting 免疫印迹分析表明，能够使得 A549 细胞中炎细胞因子 MCP-1，IL-6，TGF-β1，以及细胞粘附分子 ICAM-1 和核因子 NF-κB 的表达显著降低。体内实验研究健脾化瘀方能 够通过免疫作用抑制了 Lewis 肺癌 C57BL/6 小鼠肿瘤生长。健脾化瘀方 对 C57BL/6 小鼠 Lewis 肺癌皮下移植瘤有显著的抑制作用，能够显著抑 制小鼠肿瘤的体积、重量增长，高中低剂量健脾化瘀方的抑制率分别为： 64.48±8.9%，54.12±17.72%，27.73±10.31%。除此之外，健脾化瘀方能够 显著升高胸腺、脾脏指数。 ELISA 检测显示健脾化瘀方能够显著降低荷 瘤鼠血清中炎症因子 TNF-α、IL-8 和 IL-10 的水平。研究结果表明，健脾 化瘀方能够诱导非小细胞肺癌的肿瘤细胞的增殖，诱导细胞凋亡，其作 用机制可能与相关的炎症反应改善免疫系统有关。 结论： 健脾化瘀方可明显抑制肺癌细胞的增殖，并能够诱导 A549 细胞凋亡其可能机制为调控凋亡、炎症相关基因，以及下调炎症细胞因 子 MCP-1，IL-6 和 TGF-β1 水平，细胞核因子 NF-κB 的蛋白表达，以及 细胞粘附分子 ICAM-1 的表达有关。健脾化瘀方对 C57BL/6 小鼠 Lewis 肺癌皮下移植瘤有显著的抑制作用，并提高了小鼠的胸腺指数，脾指数； 降低了小鼠血清中炎性细胞因子 TNF-α, IL-8 和 IL-10 水平，其对移植瘤 抑制作用可能与通过免疫调节炎症细胞因子有关。 关键词：健脾化瘀方；皮下移植瘤；细胞凋亡；炎性因子；免疫调 节 The Mechanism Research on the Inhibition Effect of Jian-Pi-Hua- Yu-Fang in vitro and vivo ABSTRACT Objective: This experiment has observed the effect of Jian-Pi-Hua- Yu-Fang in vitro on lung carcinoma cel