假单胞杆菌Pseudomonasxm耐盐相关基因的克隆及其转化初探-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

假单胞杆菌觑f砌m伽嬲xm耐盐相关基因的克隆及其转化初探’． 假单胞杆菌觑f砌m伽嬲xm耐盐相关基因的克隆及其转化初探 ’． -I 摘要 在厦门盐场的饱和盐池水中发现了一株假单胞杆菌属的极端嗜盐细菌，经 初步检测认为，该菌可能是一薪种，暂定名为Pseudomonasm。以该菌为材料， 制备其总DNA，经过限制性内切酶Sau3A I部分酶切，回收纯化1～9 kb大小 的DNA片段。提取载体质粒pUCl9，用Sau3A I的同尾酶Ba删I将其切成线 状并用碱性磷酸酶(CLAP)处理，然后用T4 DMA连接酶将回收片段与线状载体 连接，转化大肠杆菌JMl09，构建Pseudomonas Xln部分基因组文库。将获得的 重组转化子挑取至含氨苄青霉素(100 ta g／m1)和696 NaCl的LB培养基上筛选 出能够耐盐的阳性克隆，从中获得与细菌耐盐性有关的约8．8kb的DNA片段。 对该片段进行亚克隆分析，最终得到了4．2kb大小的与耐盐有关的DNA片段。 (为了能测定该4．2kb片段的耐盐效果，将其与蓝藻基因整合平台供体质粒 pUcR进行重组，转化淡水蓝藻S sp PCC 7942 藻，其耐盐性有了明显提高；经多代培养后转化藻株的耐盐性状还比较稳定。 提取转化藻的总蛋白进行双向电泳分析，发现转化藻的蛋白电泳图谱出现两个 新的特异蛋白，其分子量分别约为52KD和26KD。 将该4．2kbDNA片段进行测序分析，发现它含有3个开放阅读框(ORE)。 第一个OgY为510bp，可能编码某种转录调控因子；第二个ORF最大，为 1365bp，其编码产物可能是NADH脱氢酶；第三个ORF有705bp，可能是编 码磷酸甘油磷酸酯酶的基因，该酶单方向催化甘油的合成。广—≯ 由于该4．2kb DNA片段可能带有较完整的转录构件，将其与植物双元质粒 载体pCArCn31A 1301重组，转化空心菜愈伤组织，瞬时表达检测呈阳性：再通 过SouthernBlot证明，该4．2kb外源DNA片段已经整合至植物基因组中。因此 可以初步认为，我们已经初步建立起了空心菜遗传转化系统。 关键词假单胞杆菌廷亟西区蠹基嘲盐胁迫 基因克隆 h J 前 前 言 一耐盐分子生物学研究进展 土壤盐渍化是影响农业生产和生态环境的严重问题，全世界的盐地约占陆 地面积的三分之一。我国15亿亩的耕地中约有1亿亩的盐碱地，另外还有5 亿多亩盐碱荒地，且有逐年增加的趋势。而地球E的淡水资源仅占地球表面水 资源的1．6％，这对于一百多万种动植物和50多亿人。口而言，显然是不足的。 在人口不断增加，耕地面积日趋减少和淡水资源不足的严重压力下，如何利用 大面积的盐碱地、荒漠化土地和丰富的咸水资源发展农业，是生物科学工作者 迫切需要解决的重大课题。人们曾试图通过合理的灌溉、淡水洗涤、施用化学 改良剂等方式来改造盐碱地，但是这些措施的实施不仅耗资大，见效少难以推 广，而且往往使土壤的天然肥力降低，物理化学性质变劣。人类在过去几百年 与盐碱地斗争的过程中逐渐形成一个共识：采取以生物学为主的综合措施来解 决这个世界性的难题1 Io因此加强对植物耐(抗)盐生理生化研究，提高植物 抗盐性，培育抗盐植物已经成为开垦、利用盐碱地面临的重要课题。 采用传统的方法选育耐盐碱的作物品种虽然简便可行，但进展缓慢，至今 培育出的耐盐品种还屈指可数。随着分子生物学技术的发展，人们寄希望于基 因工程育种。据悉，目前已有一些科学家克隆得到了一些与耐盐性相关的单个 基因，并把它们分别导入植物中，使后者的耐盐性有所提高，但是还没有得到 真正意义上的耐盐作物。这是因为植物的耐盐性是多种抗盐生理性状的综合表 现，由位于不同染色体上的多个基因控制210鉴于目前培育转基因作物的方法 已经比较成熟，培育耐盐作物面临的最大挑战就是分离高效的、对植物耐盐性 发挥关键作用的基因，也就是所谓耐盐相关基因”】。虽然在过去的十几年中克 隆了一些耐盐相关基因，但进一步的分离克隆耐盐相关基因仍是非常重要的工 作。这对于进一步深入了解生物的耐盐机制并获得真正意义上的抗盐植物有重 要的理论及实践价值。 限制植物生长最重要的因素是环境胁迫，其中以盐渍化和干旱最为严重。 据报道在导致农作物减产的诸种因素中，盐渍1匕的影响占70％以上【41。盐胁迫 是由渗透胁迫和离子胁迫组成的，在盐胁迫下植物的外部形态和内部的生理生 化特性都发生了一系列的变化。 首先，盐分对个体形态发育上具有显著的影响，整体表现就是盐胁迫抑制 了植物组织和器官的生长，加速了发育过程，使营养生长期和开花期缩短。长 了植物组织和器官的生长，加速了发育过程，使营养生长期和开花期缩短。长 时间处于盐胁迫下，植物叶片面积缩小，这可能是由于盐分影响了细胞分裂和 细胞延伸的速