碱性成纤维细胞生长因子（BFGF）对局灶性脑缺血的脑保护作用及对NO的影响-细胞生物学专业论文.docxVIP

中 中 文 摘 要 刖 Y 碱性成纤维细胞因子(Basic fibroblast growth factor．,-BEI疆)是一j 一种有效的神经营养性和血管活性多肽。本鲰的目的是研究短 暂MCAO诱导局灶脑缺血后BFGF在不同时间的表达及细胞分布 情况。局灶性脑缺血后应用BFGF，评价BFGF对NO的影响，以 探讨BFGF对缺血脑组织的保护作用。 f f 材料与方法 一、动物来源及分组 健康Wistar大鼠，共55只，雄性，体重280±30克。随机分组 I、对照组：正常对照组n=5。2、实验组：(1)缺血组：1—6组，动 物缺血120分再灌注6小时为1组；再灌注12小时为2组；再灌 注24小时为3组；再灌注3天为4组；再灌注4天为5组，再灌注 7天为6组。每组n=5。(2)缺血治疗组：(BFGFl00trg／kg溶于 生理盐水中腹腔注射，缺血后即刻给药)，再灌注6小时为l组，再 灌注12小时为2组，再灌注24小时为3组，再灌注72小时为4 组。每组n=5。以缺血组作为对照组(腹腔内注射生理盐水)。 二、大鼠短暂脑缺血动物模型建立 腹腔注射10％水合氯醛3．5ml／kg体重麻醉，动物仰卧位固 定于手术台上，颈正中切开，手术显微镜下分离右侧颈总动脉 (CCA)、颈外动脉(ECA)，颈内动脉(ICA)，热凝并切断ECA两分 支枕动脉，甲状腺上动脉，结扎并游离ECA主干一段，沿ICA分离 ICA的颈外分支翼腭动脉(PPA)，穿线沿其起点结扎，ECA近端备 线，用动脉夹暂时阻断CCA及IcA，轻轻向下牵拉ECA残端，在 ECA剪一小口，将制备好的直径0．2mm，头端0．5mm的尼龙线插 ECA剪一小口，将制备好的直径0．2mm，头端0．5mm的尼龙线插 入ECA，扎紧备线，放开动脉夹，轻轻推进尼龙线，经CCA分叉处 通过ICA人颅至大脑前动脉(ACA)，阻断右侧大脑中动脉(MCA) 所有血液来源，尼龙线插入深动距分叉为18．5 d-O．5mm，缝合皮 肤，外留lcm长尼龙线头。缺血时间为2小时，再灌注时轻轻提 拉所留线头，至到阴力时提示尼龙线至颈外动脉残端。如动物已 清醒，需再次麻醉后再灌注。 三、免疫组化染色。取相邻切片分别进行兔多抗染色。具体 步骤： 1、用二甲苯及乙醇处理标本脱石蜡。 2、3％过氧化氢孵育5分钟，消除内源性过氧化酶活性。 3、蒸馏水冲洗，0．01MPBS洗3次，每次3—5分钟。 4、封闭用正常羊血清工作液温孵育lO分钟。 5、滴加BFGF兔多抗，4℃过夜。 6、0．01MPBS洗3次，每次3—5分钟。 7、滴加生物素标记的第二抗体，37℃孵育30分钟。 8、0．01MPBS洗3次，每次3—5分钟。 9、滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵自素，37。c孵W 30分。 10、0．01MPBS洗3次，每次3—5分钟。 1l、滴加新鲜配制的DAB液，观察显色情况。 12、自来水冲洗中止反应。 13、苏木素复染，梯度洒精脱水，二甲苯透明中性树胶封片。 14、阴性对照：以0．01MPBC置换—抗。 四、NO测定 所有标本均于灌注固定前取心脏血4ml，4小时内予2．0ml 75mmol／IZnSO‘，摇匀后，3000r／rain离心10rain，分离血浆，分装于 试管中-20。C保存备检。NO澍定采用钟点法。 ·2· 结 结 果 一、免疫组化结果： l、在阴性对照组中发现BFGF免疫阳性细胞。 2、BFGF在神经元和胶质细胞中有BFGF免疫阳性细胞表 达。 3、BFGF免疫阳性表达的细胞数与对照组比较，无论是梗塞 区还是梗塞周围区，无论神经元还是神经胶质细胞，在缺血再灌注 6小时、12小时、1天、3天、4天均有显著增加，1天时达高峰，3天 时开始下降，7天时只有少量表达，在缺血对侧没有BFGF表达。 4、缺血周围区BFGF免疫阳性细胞高于梗塞区。 5、在软脑膜、室管膜细胞及脉络丛有BFGF免疫阳性细胞表 达。 二、NO测定结果： 用药组与对照组比较，再灌注2小时，24小时，3天各时点NO 水平明显降低。用药后该组NO随缺血再灌注过程的发展，NO缓 慢升高。 讨 论 BFGF是一种有效的神经营养和血管活性多肽，可以减轻局 灶缺血后大脑损伤程度。本研究提示在短暂MCAO后，早期BF- GF表达上调，神经元和非神经元均有表达，这一结果与1wata报导 相同。 本研究发现BFGF在梗塞周围皮层，在梗塞周周白质均有表 达。BFGF免疫阳性细胞在梗塞周围区表达高于缺血中心区。 BFGF可能通过促进脑组织中多种神经元存活，并具有促进轴突 -3· 生长作用，对抗兴奋性氮基酸及多种神经毒性物质所造成的神经 生长作用，对抗兴奋性氮基酸及多种神经毒性物质所造成的神经 元损害。因BFGF在脑组织含量高，靶细胞广，神经营养作用活性 强，故BFGF可