甲状旁腺激素（PTH）介导的高转换型肾性骨病的分子机理分析-内科学(肾脏病)专业论文.docxVIP

上海第二医秘大学肄士学位论文甲状旁腺激素(PTH)介导的高转换型肾性骨病的分子机理研究 上海第二医秘大学肄士学位论文 甲状旁腺激素(PTH)介导的高转换型肾性骨病的分子机理研究 中文摘要 肾性骨病(Renal Osteodystrophy,ROD)是慢性肾功能衰竭(CRF)常见、严 重、治疗困难的并发症。当GFR50％时，ROD的发生率为50％。当GFR10ml／min 时，几乎100％的CRF患者发生ROD。ROD的发病机理未明，传统的认识认为 与PTH．VitD轴和Ca、P代谢紊乱有关，尤其与PTH密切相关，外周血PTH水 平可大致估计ROD的类型。近年越来越多的认识到各种局部或循环的细胞因子 和生长因子在ROD的发病中发挥重要作用。2001年，Hoflgauer等将各种调节骨 代谢的上游激素和因子收敛为最终刺激或抑制成骨和基质细胞表达的骨保护素 配体(RANKL)和诱饵受体(OPG)及破骨细胞表达的膜受体(RANK)，这三者 构成了对破骨细胞分化、活化与凋亡的三角调节关系。成骨细胞可同时表达 RANKL和OPG。RANKL的生物学作用是与破骨细胞膜上的RANK结合，刺激 破骨前体细胞的分化和活化成熟，并抑制破骨细胞的凋亡，其直接后果是导致骨 吸收增加。而OPG的生物学作用是竞争结合并中和成骨细胞膜上的RANKL，阻 断RANKL与破骨细胞膜上的RANK结合，从而抑制破骨细胞的分化与成熟，其 直接后果是导致骨吸收减少。动物实验已经证实，PTH对骨代谢具有双相作用， 即间歇给药促进成骨，而大剂量持续给药则促进骨吸收。在高转换型肾性骨病时， PTH异常增高，病理上以破骨细胞大量增生形成骨吸收陷窝为主要表现。由于 OPG／RANKL／RANK系统参与了破骨细胞的活化和成熟，故高转换型肾性骨病 中，PTH的溶骨作用是否涉及OPG／RANKL／RANK系统基因和蛋白质表达的调 控及其传导通路，从而刺激破骨细胞活化导致的骨吸收，是本研究的目的。 第一部分：高转换型肾性骨病中骨保护素及其配体的表达和形态计量学观察 选择lO例慢性肾衰、尿毒症患者和3例正常人进行骨活检术获得骨组织标 本，采用免疫组化方法检测OPG和RANKL蛋白质的表达，采用全自动图象分 析系统进行骨组织形态计量学测定。结果显示：lO例慢性肾衰尿毒症患者经骨病 理学检查证实均为高转换型骨病，以破骨细胞活化形成骨吸收陷窝伴或不伴骨矿 化不全为特点。免疫组化显示尿毒症患者骨组织中以RANKL阳性表达为主。与 兰塑竺墅鉴堂生丝垄墨二正常对照相比，RANKL阳性表达细胞数日呈显著增加趋势，OPG阳性表达细胞 兰塑竺墅鉴堂生丝垄墨二 正常对照相比，RANKL阳性表达细胞数日呈显著增加趋势，OPG阳性表达细胞 数目呈显著减少趋势。骨组织形态计量学分析显示尿毒症患者RANKL的阳性表 达细胞数目与骨吸收面积和破骨细胞数目呈显著正相关。提示，高转换型肾性骨 病中，PTH的溶骨作用是通过OPG触NKL，RANK系统介导的。 第二部分：人甲状旁腺激素(hPTH)对体外培养胎鼠颅盖骨成骨细胞增殖、分 化和骨保护素及其配体表达的影响 采用原代培养的胎鼠颅盖骨成骨细胞．经检验具有成骨细胞表型的第二代细 胞用于实验，分别将hPTH(1．34)以O．01、O，1、1、10、100 ng／ml五个终浓度加 入培养液，采用MTT方法在细胞培养的第1、3、5天分别检测成骨细胞的增殖 率：在培养细胞的不同阶段(O．18天)，采用RT-PCR方法半定量OPG和RANKL 基因的表达变化；采用Westernblot方法检测OPG和RANKL蛋白质的表达水平： 采用ELISA方法检测培养上清液中PICP和AKP水平。结果显示：100ng／ml hPTH(1．34)在细胞培养的第5天显著抑制成骨细胞的增殖；在细胞培养的第18 天显著抑制成骨缅胞的分化；在整个细胞生长期均抑制OPG基因和蛋白质的表 达，但能明显上调RANKL基因和蛋白质的表达，且最大效应发生在成骨细胞 的分化期。提示，OPG／RANKL／RANK系统介导了PTH的溶骨作用，早期可能 与OPG减少，而晚期与鼬NKL增加有关。 第三部分：人甲状旁腺激素(hPTH)对调节骨保护素及其配体基因表达的PKA 和PKC传导通路影响的比较研究 采用原代培养的胎鼠颅盖骨成骨细胞，经检验具有成骨细胞表型的第二代细 胞用于实验，在抑制传导通路的研究中，细胞培养5天和6天后，分别加入 Calphostin．C 500nmol／L24小时和H．89 30umol／L4小时。在刺激传导通路的研究 中，细胞培养5天后，加入PMAl0-7mol／L24小时后，分别加入和不加入hPTH(1—34) 100ng／ml，继续培养2小时和6小时分别收集细胞，采用RT-PCR方法半定量 OP