甲型副伤寒沙门菌MLVA分型方法的建立及应用病原生物学专业论文.docxVIP

PAGE PAGE 10 甲型副伤寒沙门菌 MLVA 分型方法的建立及其应用 硕士研究生：盘 箐 导 师：刘 劼 副教授 中文摘要 研究目的：建立甲型副伤寒沙门菌（Salmonella paratyphoid A，SPA）多位点可 变 数 目 串 联 重 复 序 列 分析 （ Multiple-Locus Variable number tandem repeat Analysis，MLVA）分子分型方法，并用于云南甲型副伤寒沙门菌的分型分析。 材料和方法：21 株 SPA 参考菌株购买于中国医学细菌保藏管理中心，194 株应 用于分型分析的 SPA 临床分离株分离自 2005-2009 年中国云南省玉溪市。应用系 统测试法，根据国际测序株 A-9150 和 A-12601 的基因组测序结果，首先用 TRF 软件筛选和鉴定串联重复位点，然后基于序列和标本测试筛选多态性串联重复序 列（Variable number tandem repeat，VNTR）。设计引物，PCR 扩增 VNTR,通过普 通琼脂糖凝胶电泳、毛细血管电泳和测序确定 VNTR。最后将筛选结果应用于 194 株临床分离株的分型，用 Bionumerics 软件效用均等的分类资料 UPGMA 分 析方法对分析结果进行聚类分析，以分类图或者最小扩展树的形式展现聚类分析 的结果。 研究结果：应用 TRF 软件在 A-9150、A-12601 菌株中鉴定了 1591、1512 个重复 位点，并发现 TR27 在 2 个基因组中重复数目呈现多态性。第一轮筛选出 51 个 位点，它们的 TRF 报告得分大于 80%，或者位点重复拷贝数大于 3，或者同源 性大于 85%的位点。然后设计引物，用 21 株 SPA 现实菌株确定了 12 个位点具 有扩增条带多态性。通过测序分析确定 9 个位点（指标）的 PCR 产物大小变化 由 VNTR 重复数的不同引起，经过分型效能分析筛选，最终确定 9 个用于 SPA MLVA 分型的指标，即 TR5、TR51、TR24、TR27、TR40、TR41、TR43、TR44、 TR49。21 个参考菌株分为 14 个 MLVA 型别。云南省玉溪市 194 株临床分离菌 株分为 9 个 MLVA 型别，其中流行区域主要为红塔区，15 型为其优势型别。194 株进行最小生成树分析代表菌株为 6 株 11 型菌株以及 2 株 16 型菌株和 2 株 14 型菌株，而澄江县 09620 菌株（13 型）、江川县 08140（17 型）、红塔区 07085 （18 型）各为一类型。同时与参考菌株比较结果显示，菌株 50433（保加利亚）、 50508（广东省疾病预防控制中心）、50509（广东省疾病预防控制中心）的亲缘 关系与红塔区较为疏远，50002（丹麦）、50504（大连生研所）的亲缘关系与新 平县菌株较为疏远，保加利亚 50433、丹麦-上海同济 50002 等菌株与 194 株中国 云南玉溪的人源菌株在 MLVA 分型方面没有关联。以 08140 菌株作为基点分为 三个簇，其中第一簇（05115、06036、09616、09622、09532、09639）为同一类 型（76 型），与 08140 菌株比较具有单一 MLVA 基因位点不同。第二簇与 08140 比较具有 2 个 MLVA 基因位点不同的评价菌株为 50101、50507、50078、50672 和 50434；3 个 MLVA 基因位点不同的菌株为 50154；5 个 MLVA 基因位点不同 的是评价菌株 50674。第三簇均为 2 个 MLVA 基因位点不相同，评价菌株分别为 50501、50502、50506、50001、9150（ATCC）、50503、50084。 结论：1）首次建立了甲型副伤寒沙门菌 MLVA 分型方法； 2）MLVA 分型应用于甲型副伤寒沙门菌分型具有较好的应用价值，发现 了云南省玉溪市甲型副伤寒沙门菌的流行优势菌株和流行地区； 3）红塔区 SPA 的暴发流行可能对整个玉溪市 SPA 的暴发流行起关键作用， 应加强对红塔区 SPA 的监测； 4）云南省玉溪市应加强 MLVA 15 型甲型副伤寒沙门菌的预防，同时不容 忽视其它型别菌株的监测。 关键词：甲型副伤寒沙门菌；多位点可变数目串联重复序列分析；多态性串联重 复序列；分子分型 Establishment and application of Multiple-Locus Variable Number of Tandem Repeat Analysis for Salmonella Paratyphoid A Abstract Objective: To set up a Multi