接头蛋白SLAT对类风湿关节炎Th17细胞分化的作用-内科学专业论文.docxVIP

四刖医科太堂亟±堂僮监塞目 四刖医科太堂亟±堂僮监塞 目 录 接头蛋白SLAT对类风湿关节炎Th l 7细胞分化的作 1 1．1 中文摘要 2 1．2 英文摘要 6 1．3 前言 11 1．4 材料与方法 17 1．5 结果 33 1．6 讨论 49 1．7 结论 51 1．8 参考文献 52 1．9 英汉缩略词对照表 56 2 致谢 58 3 血清学阴性类风湿关节炎诊治进展(综述) 60 4 攻读硕士学位期间发表论文及参与科研项目 79 万方数据 接头蛋白SLAT对类风湿关节炎Thl7细胞分化的作用摘 接头蛋白SLAT对类风湿关节炎Thl7细胞分化的作用 摘要背景：类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是以多关节炎为主要表现 的慢性自身免疫性疾病，最终导致关节畸形，功能丧失、致残。虽然RA 的病因和发病机制还不清楚，但目前所知CD4+T细胞分化为不同的功能 性Th细胞亚群，导致机体炎症反应是RA发病的中心环节。Thl7细胞是 新近发现的一种能特异性产生IL．17的Th细胞亚群，通过几．17受体等途 径作用于效应细胞，造成机体的损坏。因此Thl7细胞在RA发病中起关键 作用。初始CD4+T细胞向Thl7分化依赖于两个方面信号：一是TCR(T 细胞抗原受体)，二是细胞因子受体。目前对Thl7细胞分化的研究集中在 激发的细胞因子途径中而对TCR途径研究甚少。而TCR途径是T细胞活 化、Thl7分化必需的信号之一，因此，从TCR途径出发，研究Thl7细胞 的分化机制是对其分化途径新的重要探索。TCR信号转导过程中，接头蛋 白(adapter proteins)分子起着重要的衔接和调控作用，往往是信号复合体 (signaling complex)的核心成分。T细胞接头蛋白(SLAT)，是一种鸟甘酸 交换因子(GEF)，高表达于胸腺细胞和外周血T细胞。SLAT通过效应细 胞造成骨质破坏。因此，SLAT通过TCR信号途径在T细胞免疫应答中扮 演了崭新和重要角色。 目的：1、研究SLAT在活动期RA患者CD41细胞中的表达，同时进行 SLAT表达水平与外周血、关节液中Thl7细胞比例相关分析，观察SLAT 在活动期RA患者外周血及关节液与正常人外周血之间的差异。2、检测在 万方数据 诱导刺激后SLAT及与Thl7细胞变化的关系。 诱导刺激后SLAT及与Thl7细胞变化的关系。 方法：根据2010ACR／EULAR分类标准采集20例活动期RA患者外周血， 同时抽取其膝关节关节液作为病例组。并采集15例正常人外周血作为对照 组。(1)采集这20例活动期RA患者的空腹静脉血检测血沉(ESR)、C 反应蛋白(CI冲)、类风湿因子(RF)、抗环瓜氨酸多肽抗体(ACPA)检 测并对RA患者关节炎症进行评估计算DAS28评分。标本用EDTA抗凝管 收集，利用密度梯度离心分别提取外周血单个核细胞(PBMC)和关节液 单个核细胞(SFMC)。加入混合刺激液刺激(PMA、离子霉素和莫能霉素) 4h后加入流式抗体BV510 Anti—human CD4、PE—Cy7 Anti-human IL-17、同 时加入Anti。SLAT后加入二抗Donkey Anti。Rabbit 488上机检测。 (2)采 集外周血分离PBMC，在诱导Thl7分化的体外环境中培养、刺激及实施 沉默。A组加入T-Activator CD3／CD28；B组加入T-Activator CD3／CD28 以及TGF-p、IL．23、I“。C组为沉默组加入CD4 Aptamer-SLAT shRNA chimera，对SLAT干扰沉默。放入37℃C02孵箱内培养72h。通过流式细 胞术检测SLAT、Thl7细胞相关指标在之间的表达差异。(3)分离PBMC 免疫磁珠去除分选法分选CD41细胞，培养刺激分组同上，收集细胞培养 液上清用ELISA检测m．17、TNF．cc、IFN-y。用Real time-PCR法检测SLAT 基因的表达水平； 利用流式细胞技术检测以计算平均荧光强度MFI表示 SLAT在蛋白水平的表达。(4)观察CD4+T细胞在刺激培养以及沉默后各 组中的SLAT的表达。利用SPSS20．0软件进行统计学分析。 结果： 1． 正常人外周血SLAr CD4+T细胞为(21+2．4)％，活动期RA患者 万方数据 外周血SLAT+CD4+T细胞为(524．3．6)％，RA患者关节液SLAT+CD4+T 外周血SLAT+CD4+T细胞为(524．3．6)％，RA患者关节液SLAT+CD4+T 细胞为(47+3．8)％；活动期RA患者外周血及关节液SLAT+CD4+T细胞 高于正常对照组(P0．01)。 2． 正常人外周血Thl7细胞为(O．