角蛋白酶毕赤酵母工程菌的构建及酶学性质研究-微生物学专业论文.docxVIP

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书学位论文 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密 否 如需保密，解密时间 年 月 日 LIIIIUlllHIllUilllllll qllIIII 独创性声明 Y3053332IHIH 本人声明所呈交的论文是我个人在导蜘指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所徽的任 何贡献均已在论文中做了职确的说明，并表示了谢意． 研究生签名：嘶住蓉 时间： 矽，6年 ‘月 峥B 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文．本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，为存在馆际合作关系的兄弟高校用户提供文献传递和交换服务，同时 本人保留在其他媒体发表论文的权力． 注：保密学位论文e辟涉及技米秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文)在解密詹适用于本授权书． 学位论文作槲：晔婕、 导师挠枣妻印 签名日期：彻1‘年1．月中日 签名日期：加坫年参月牛日 注：请将本表喜接装订在学位论文的扉页和目录之间 万方数据 角蛋白酶毕赤酵母工程菌的构建及酶学性质研究目 角蛋白酶毕赤酵母工程菌的构建及酶学性质研究 目 录 摘要 ．．i Abstract． ． ． ． ． ． ． ．． ．． ． ． ．． ． ．． ． ． ． ． ． ．． ． ． ． ． ．．iii l前言 ．．1 1．1角蛋白的简介 1 1．2角蛋白酶的研究现状 1 1．2．1角蛋白酶的来源与分类 ．．1 1．2．2角蛋白酶的性质 。2 1．2．2．1分子量 2 1．2．2．2最适pH ．．2 1．2．2．3最适温度 3 1．2．2．4各种离子和试剂的影响 3 1．2．3角蛋白酶的作用机制 ．．3 1．2．3．1机械压力假设 3 1．2．3。2硫解作用假设 4 1．2．3．3膜电位假设 4 1．2．3．4复合酶假设 4 1．2．4角蛋白酶基因的研究 。5 1．2．5角蛋白酶基因的异源表达 。5 1．2．6角蛋白酶的应用 ．．6 1．3毕赤酵母表达系统 7 1．3．1宿主细胞 ．．8 1．3．2表达载体 ．．8 1．3．3表达策略 ．．9 1．3．3．1启动子 9 1．3．3．3信号肽 9 1．3．3．4 G+C／A+T含量 ．10 1．3．3．5密码子偏好性 ．．11 1．3．3．6基因剂量效应 ．．11 万方数据 华中农业大学2016届硕士研究生学位论文1．3．3．7目的蛋白的稳定性 华中农业大学2016届硕士研究生学位论文 1．3．3．7目的蛋白的稳定性 12 1．3．4发酵条件优化 ．12 1．3．4．1碳氮源 12 1．3．4．2温度 13 1．3．4．3 pH值 ．13 1．3．4．4甲醇的添加速率 ．．13 1．3．4．4溶氧值(DO) ．．13 1．4本研究的目的和意义 14 2材料与方法 ．．14 2．1材料 ．．14 2．1．1菌株和质粒 ．14 2．1．2培养基和抗生素 ．14 2．1．3实验试剂和溶液 ．1 5 2．1．4仪器 1 7 2．2角蛋白酶基因的优化克隆与测序 17 2．2．1角蛋白酶基因密码子的优化 ．17 2。2。2基因序列的PCR扩增与酶切 ．．18 2．2．3目的基因与质粒载体的酶连反应 19 2．2．4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 ．19 2．3角蛋白酶基因在毕赤酵母中的表达 20 2．3．1毕赤酵母感受态细胞的制备 ．20 2．3．2重组质粒的转化 ．2 1 2．3．3高拷贝重组菌的筛选 ．22 2．4角蛋白酶基因的表达及产物的检测 22 2．4．1重组菌的诱导表达 ．22 2．4．2TCA沉淀 ．22 2．4．1表达产物的SDS．PAGE检测． 23 2．5酶学性质研究 23 2．5．1角蛋白酶活的测定 ．23 II 万方数据 角蛋白酶毕赤酵母工程菌的构建及酶学性质研究2．5．2粗酶液最适反应温度、pH及温度、pH的稳定性 角蛋白酶毕赤酵母工程菌的构建及酶学性质研究 2．5．2粗酶液最适反应温度、pH及温度、pH的稳定性 24 2．5．3粗酶液最适反应pH 。24 2．5．4粗酶液的温度稳定性 24 2．5．5粗酶液的pH稳定性 ．24 2．5．6不同金属离子对粗酶液的影响 24 2．5．7有机溶剂和表面活