金葡菌肠毒素A基因及其突变体表达产物生物学活性研究-病原生物学专业论文.docxVIP

浙江大学硕士学位论文实验方法采用高保真PCR和1氇克隆法，从金黄色葡萄球菌ATCCl3565株DNA 浙江大学硕士学位论文 实验方法采用高保真PCR和1氇克隆法，从金黄色葡萄球菌ATCCl3565株DNA 中扩增并克隆了不含信号肽序列的SEA基因。采用突变引物PCR构建SEA基因定位突变 体。建立SEA基因及其定位突变体原核表达系统。NioNTA亲和层析法提纯表达的目的重 组蛋白，SDS．PAGE鉴定，并对纯化的重组蛋白进行透析复性和滤过除菌。采用TCIDso 法测定目的重组蛋白对Vero细胞的细胞毒性。采用MTT比色法分别检测不同浓度的目的 重组蛋白促小鼠脾细胞增殖及对抑制KB及HL．60癌细胞株生长的作用。 结果所克隆的SEA基因核苷酸序列与报道序列的相似性为100％，7种突变体均在 既定位置获得预期的密码子突变．rsEA和各突变体重组蛋白表达量约为细菌总蛋白的 52％。rSEA对Veto细胞TCIDso为4．1 pg，其突变体重组蛋白分别为5．8-23．5 lag。l和5 Ilg／na 的rsEA及其5种突变体重组蛋白rsE～．H187A、rSEA，H225A、rSEA／D227A、 rsEA／H187A／D227A和rSEA／H225加227A对小鼠脾细胞均有明显的促增殖作用 (Po．05)，10和20¨咖l的rSEA及上述5种突变体重组蛋白促小鼠脾细胞增殖活性与 100 ttg／ml PHA相似(pO．05)。如20 ttg／mi的rSEA及上述5种突变体重组蛋白作用的小 鼠脾细胞上清及其上清与脾细胞混合物均能有效地抑制KB和HL．60细胞生长(P．O．05)。 结论本研究成功地构建了SEA基因突变体及其高效原核表达系统，其表达产物的细 胞毒性均有所降低。由于rSEA／H225A’rSEA／D227A、rsEA／H225A／D227A细胞毒性较低、 促脾细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长活性较强，可作为研制升白细胞、抗肿瘤SEA相关药物 的候选突变体。 关键词葡萄球菌肠毒素A；SEA基因／定位突变；原核表达系统／构建；重组蛋白 ／细胞毒性；脾细胞／增殖；肿瘤细胞／抑制 2 浙江大学硕士学位论文Construction 浙江大学硕士学位论文 Construction of the site—specific mutants of staphylococcal enterotoxin A gene and biological activities of their recombinant expression products Department ofMicrobiology and Parasitology College ofMedical Science，Zhejiang University Postgraduate Fan Fanghua Tutor Prof．Yan Jie Abstract Background and 0bjective Staphylococcal enterotoxins，usually produced by Staphylococcus aureus，have been found SO far to call be divided into five types SEA-SEE based on the differences of antigenicity．Of these five enteromxins,SEA,SEB and SEC were well demonstrated tO be the most effective stimulants for proliferation and activity of T lymphocytes ofhuman and mammal origin．SEA-SEC at a very low dosages(ng or Pg)carl efficiently induce the mitosis of lymphoblast and promote T lymphocytes releasing multiple cytokines to kill various tumor cells by way of cytotoxicity．Therefore,SEA—SEC show a potential to be developed into a kind of peptide drug for increasing leukocyte and anti-tumor in human． However,SEA-SEC，even though at very low dosages，Can cause diarrhea and