结直肠癌抗原特异性T细胞扩增与制备的关键技术研究-肿瘤学(免疫与生物治疗)专业论文.docxVIP

解放军医学院硕士学位论文作 解放军医学院硕士学位论文 作 者：刘 洋 学科专业：肿瘤学 导 师：郭亚军 结直肠癌抗原特异性T细胞扩增与制备的关键技术研究 中文摘要 目的：结直肠癌(CRC)在我国的发病率和致死率呈不断上升趋势。包括免疫治 疗在内的综合治疗在结直肠癌治疗中起到越来越重要的作用。通过多种方式用肿 瘤抗原刺激自体淋巴细胞获得抗原特异性杀伤细胞的研究众多，肿瘤细胞丧面的 抗原被抗原提呈细胞(APC)加工成抗原肽与主要组织相容复合物(MHC)分子 形成复合物提呈给T细胞并诱导其活化，形成肿瘤抗原特异性的细胞毒性T淋巴细 胞(CTL)。转化生长因子DII型受体(TGFl3RII)和。位N．乙酰葡萄糖胺糖基转移 取OGT)基因的框移突变产生的两种新生抗原具有HLA-A2限制性，存在于20-40％ 的HLA—A2限制性结直肠癌患者且不存在于正常人和其他肿瘤患者，提呈后的抗原 肽分别为TGFl3RII(RLSSCVPVA，13l一139)和OGT(SLYKFSPFPL，28．37)。肿瘤 为了逃避识别，下调甚至不表达MHC分子，部分肿瘤患者免疫细胞数下降功能低 下都会造成肿瘤抗原无法提呈，导致T细胞无法活化。针对上述T细胞无法活化的 现状，我们人工合成抗原肽并与患者的外周血T细胞共培养，以提高结肠癌特异性 T细胞的活化效率。接下来，用树突状细胞(DC)结合抗原肽诱导活化杀伤性T细 胞与抗原肽直接刺激活化细胞比较杀伤效能，以期获得同等或者更好的杀伤效果 且减少体外对细胞操作，降低副反应发生率。综上所述，本课题旨在构建简便有 效的肿瘤特异·PT兰m胞的制备方法，以达到增强特异性同时降低更加安全的目的。 方法：合成TGFl3RII(RLSSCVPVA，131．139)和OGT(SLYKFSPFPL，28．37)两段 抗原肽，质谱分析进行纯度鉴定；筛选获得表i本_TGFl3RII(RLSSCVPVA，131．139) 和OGT(SLYKFSPFPL，28．37)且具有HLA．A2限制性的结肠癌细胞系一株：DLD一1。 选择具有HLA．A2限制性的结直肠癌患者，应用密度梯度离心法和细胞因子刺激方 式分离外周血培养获得结直肠癌患者CD8+T细胞为主的外周血单个核细胞 (PBMC)混悬液，流式细胞分析鉴定刺激培养前后细胞表型及比例；使用抗原肽 万方数据 解放军医学院硕士学位论文与CD8+Tfi习胞共培养刺激活化产生抗原特异·I生CTL，MTS实验测定针对DLD．1结肠 解放军医学院硕士学位论文 与CD8+Tfi习胞共培养刺激活化产生抗原特异·I生CTL，MTS实验测定针对DLD．1结肠 癌细胞系不同效靶比的杀伤效应，ELISA方法评估了各组IFN一口分泌情况以进一步 评估CTL活化和杀伤能力。 其次，表达HLA．A2分子健康人的PBMC诱导获到成熟DC附载抗原肽刺激相应 个体T细胞活化形成抗原特异·I生CTL，比较DC疫苗诱导的CTL与直接使用抗原肽刺 激的CTL杀伤活性。 结果：我们获得的TGFl3RII(RLSSCVPVA，131．139)和OGT(SLYKFSPFPL，28．37) 抗原肽，纯眨99％，分别加入到表达HLAA2分子的结直肠癌患者和健康人PBMC， DC进而诱导形成的抗原肽特异性CTL，经MTS试验证实经抗原肽刺激2的结直 肠癌患者T细胞混悬液在第杀伤实验3天效靶比为5／1，10／1，20／1分别获得对 DLD．1的48．54％，63．62％和70．23％杀伤率，低于健康对照组的杀伤率为66．32％， 74．82％和81．61％，仅在10／1条件下无抗原肽处理患者组的杀伤能力优于健康对照， 说明抗原肽刺激无法提高结肠癌患者自体免疫细胞杀伤DLD一1的能力。另外，与 DC细胞负载抗原肽诱导形成的肿瘤抗原肽特异性CTL相比，直接使用抗原肽刺 激正常人的T细胞为主的PBMC诱导得到的特异性CTL能够对DLD一1获得更好 的杀伤效果：与DC负载抗原肽诱导形成的肿瘤抗原肽特异性CTL相比，直接刺 激获得的特异性CTL第14天在效靶比为5／l时，DC负载抗原肽l(OGT)与抗 原肽1直接刺激获得的CTL对DLD．1的杀伤率分别为26．71％和65．84％(P=0．054)， DC负载与抗原肽2(TGFflRII)直接刺激的CTL对DLD．1的杀伤率分别为20．69％ 和81．32％(P=0．039)，DC负载与抗原肽1+2直接刺激的CTL对DLD．1的杀伤率 分别为39．91％和69．24％(P=0．048)。在效靶比为10／1时，DC负载与抗原肽l直 接刺激的CTL对DLD—l的杀伤率分别为36．33％和88．82％(P=0．038)，DC负载与 抗原肽2直接刺激的CTL对DLD．1的杀伤率分别为37．51％和89．74％(P