金属硫蛋白沉默对乳腺癌转移基因表达的影响-基础医学专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 Effect of Metallothionein Silencing on Metastasis Gene in the Breast Cancer Cell Dissertation Submitted to North China University of Science and Technology in partial fulfillment of the requirement for the degree of Master of Medicine by Wei Xijun (Basic Medicine) Supervisor: Professor Jiang Xiaohua June, 2015 独 创 性 说 明 本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的 地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含 为获得华北理工大学以外其他教育机构的学位或证书所使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了 明确的说明并表示了谢意。 论文作者签名： 日期： 年 月日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解华北理工大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：已获学位的研究生必须按学校规定提交学位论文，学校有权保 留、送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以将学位论 文的全部或部分内容采用影印、缩印或编入有关数据库进行公开、检 索和交流。 作者及导师同意论文公开及网上交流的时间： □ 自授予学位之日起； □ 自 年 月 日起。 作者签名： 导师签名： 签字日期： 年 月 日 签字日期： 年 月 日 摘 要 摘 要 目的 乳腺癌是较为普遍的一种恶性肿瘤，目前数十种与乳腺癌发病、发展及转 移相关的基因已经被鉴定。本研究拟观察在乳腺癌 MCF-7 细胞中，当 MT2A 基因 表达沉默时，乳腺癌细胞的繁殖及乳腺癌转移关联基因的表达变化。 方法 利用生物信息学分析金属硫蛋白 MT2A 的序列特点设计并合成干扰载体 shRNA-MT2A，转染乳腺癌 MCF-7 细胞获得 MT2A 基因沉默型细胞株。利用观察 MT2A 基因沉默型乳腺癌细胞的繁殖变化和黏附基质的能力变化，通过 RT-PCR、 western blot 检测 FGF-1、Twist、转铁蛋白、AOP-1 和过氧化还原酶 6 等 5 个基因 在转录和翻译水平上的变化。 结果 1 设计并合成三条 shRNA-MT2A 干扰载体，通过实验最终确定一条干扰载 体用于后续研究。2 通过脂质体转染技术将 shRNA-MT2A 转入乳腺癌 MCF-7 细胞 株，得到 MT2A 基因沉默型细胞株，并通过荧光显微镜观察、半定量 PCR 技术和 western blot 技术对 MT2A 的表达情况作了鉴定。3 在 MT2A 基因缺失时，癌细胞 繁殖变化，发现乳腺癌细胞 MCF-7 繁殖速度降低，与基质的黏附能力增强。4 实 时定量 PCR 结果显示 FGF-1 和 Twist 蛋白在 MT2A 缺失的乳腺癌细胞中表达水平 变化不大。5 转铁蛋白在 MT2A 基因沉默的乳腺癌细胞中转铁蛋白的 mRNA 含量 上升。6 研究发现细胞内的 MT2A 沉默后，AOP-1 和过氧化还原酶 6 的 mRNA 水 平均上升，但是 AOP-1 基因表达上调水平高于过氧化还原酶 6 基因。7 western blot 实验分析显示在 MT2A 基因沉默的乳腺癌细胞中 FGF-1 和 Twist 蛋白水平没有发 生显著变化，而转铁蛋白、AOP-1 和过氧化还原酶 6 三种蛋白在细胞中的含量出 现上升。8 构建 MT2A 与β -domain 过表达细胞株，结果证实 MT2A 与β -domain 的过表达不影响乳腺癌细胞的繁殖，而β -domain 过表达促进细胞线粒体中细胞色 素 c 氧化酶 6B2 亚基（CYP6B2）表达量上调。 结论 本研究证实 MT2A 基因沉默型乳腺癌细胞繁殖速度变慢、与基质的黏附能 - I - 华北理工大学硕士学位论文 力增强；因为 MT 的主要功能是调节金属离子代谢和抗氧化，所以 MT2A 基因沉 默影响到了铁离子调控蛋白转铁蛋白，也影响到了抗氧化蛋白 AOP-1 和过氧化还 原酶 6 和细胞色素 c 氧化酶 6B2 亚基。 图 22 幅；表 16 个；参 62 篇。 关键词：金属硫蛋白；乳腺癌；癌转移基因；MT2A 沉默；抗氧化；金属离子代谢 调控 分类号：R737 II - 摘 要 Abstract Objectives Breast cancer is a common malignant tumor. To date, ma