结球甘蓝抗病基因克隆和分离的分析-蔬菜学专业论文.docxVIP

? 中文摘要 (州i歧是我凶的一时那栽培面积已达几十万州附 it蓝病害相当严重 常给厂大菜农造成极大经济损失。在我国，有关结球甘蓝的抗病育手中研究取得了很大的进展， 已选育出不少抗性材料和抗性较强的品种，在现有的抗病材料巾，有些材料往往伴随着经济性 状不良而难应用 -Tl:产 ， 1.1用常规的方法难以打破它们的连锁关系。传统的防治病害的方法仅 在-定范用内有效， HIjli都有J{局限性 ，如种子消毒，用化学农药防治既费时 费工，又造成环 境污 染。 随着现代化物 j去术的小 l听发展，分子生物学研究的不断深入，利川柏物农 l太1.1:权于段来辅 助植物抗病 fi利I!ld /j dl;l ijJt lj，把外切抗咐:基因导入到农作物品种中， J用问l沟J1亏9引l 削引?强忖f;ú范 其JC以义对才打?病岗吝的 J抗点I:t f成戊为叮能，从而 j 1 1] U 人)-.:}J/li庄村i吻抗病育种ill程， )f辟了植物抗的基因]祀的新时代 J 建立 ‘ - 个比较完整的 cDNA 文!斗，是 JT 展分子生物学研究的基础工作，是分离钊 :在 f刻，特别是分禹 高等真核生物基冈的有效手段，目的基因的克隆对于研究基因结构，调节机制等方面有十分重 要意义。结球甘 1佳作为找罔-一利1重要的蔬菜作物，其分子生物学研究方面远滞后于一些大阳作 物，为了分离结球 H \\ ì [jJ .些有用基因 ，本研究构建了结球甘蓝的cDNA 文库 ，并对该文库的 部分特性进付了!训穴。 {至IJ 日前为止， 已有 些通过分离克隆植物抗病基因，把抗病基民导入到抗性弱的作物吵， 以增强其抗ttlYJ 1W i.ü H{ 乡 ，己在玉米 ，番胁，亚麻，拟南芥，水稻，却菜 . 小麦等作物中，成 功克隆出许多趴纳基 l主I这些抗病基 因表现出对病毒，细菌，真菌或线 虫抗忡。 克隆这些基因 主要采用图位克 降沾手IJ 转座子标签法，这两种方法均需投入大量的人力，物力，耗时，而利用 同源序列法分离杭州基 [ l 显示出经济，快速的优点，根据抗病基因保守 n91J 设计简并引物，然 后用 PCR 法从tA1内材料的基因组或 cDNA 中扩增出应用于分离抗病基 囚的探针 ，对用含抗病 基因的材料构建的 cDN^ 文制行筛选，进而克隆出抗病基因夕在本实验1 1 亦是利用同源 序 ， 列泣，对构建的含 fA倘不囚的 cDNA 文库进行筛选，分离出一个候选抗病某肉，并对其序列以 及其编码的氨基西安Ji -:圳，蛋白质特性和结构预测方面 进行了分析研 究， FiJ IIJ _x，j 该基因亦进行了 阳淄川化的川ìJ -(狄得了以 F结果 : 1. 构建结球甘蓝 cDNA 文库 J在 SM^HT cDN^ 义1413J 建试开IJ盒说明进行操作， 文库的宿主萌为 大肠们[呆I XLI-BLue ，对文 库的部分特利 :ii)f JνjI tj: YJ : 扩增后， -文库滴度为 4XIO 吗pfu /ml ，插入片段人小J)J Ir 500bp 以上， 以 lkh 的川;戈 r 11 人车 i敬，文库重组体的重视 率为 95%，并对该文库进行了扩册，保存。 该文库 的指标均达到普通文库所需的要求，能够利用该文库进行结球甘篮 目的基因的分离和克隆。 2. 结球甘蓝抗病基因片段的分离 参照烟草的抗花叶病毒基因 N，拟南芥的抗丁香假单子包杆菌基因RPS2 及亚麻的抗叶锈病基 因 L6 的保守区域设计简并引物，其中 5 端引物为 :5 一GGlr IGTIGGIAAIACIAC-3 ，3 端 引物为: 5 -A (A/G) IGCTA (A/G) IGGIA (A !G) ICC一了。采用 PCR 热启动法，分别从高抗 TuMY 甘蓝材料 84075 幼苗的 cDNA 第一条链及基因组中扩增出 一条约 510bp 左右的 DNA 条带， 把 PCR 产物经纯化回收后，采用 T/A 克隆法，用 T4 连接酶连接 pUCm-T 载体，转化大肠杆菌 DH5 α ，利用α -互补筛选重组子，边一步通过 PCR 及酶切验证，表明目的片段己克隆进入质粒载 体中。 3. 抗病基因片段的测定及分析 分别对 RT-PCR 产物及基因组 DNA PCR 产物克隆成功的重组子进行测序，分析，挑取两个 与己克隆的抗病基因同源性比较高的重组子作探针，命名为 Borl ，Bor2，二者的片段大小为 5 13bp ，编码171 个氨基酸， 二者的核昔酸一致性为 7 1.3%，氨基酸的一致性为61.