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定量蛋白质组学研究神经元分化过程蛋白表达变化 题目：Quantitative Map of Proteome Dynamics during Neuronal Differentiation 定量蛋白质组学研究神经元分化过程蛋白表达变化 期刊：Cell Reports 影响因子：8.032 主要技术：定量蛋白质组，AP-MS 研究背景 神经元分化是一个多步骤过程，一般经过几个阶段，包括轴突生长、树突发生和突触形成、塑造和重塑神经元。但是对神经元分化过程中系统生物学动态变化研究多集中在转录组水平，基因在转录水平的变化不一定能代表最终功能执行者蛋白质的变化。因此，有必要系统的研究神经分化过程中蛋白质的动态变化。 研究内容及结果 1. 大鼠海马神经元蛋白表达谱 为了分析分化过程中神经元蛋白质组的改变，作者将大鼠原代海马神经元在无血清的神经基质培养基中培养生长，并收获轴突形成期DIV1、树突生长期DIV5、突触发生和成熟期DIV14细胞，使用蛋白质组学技术对不同时期的细胞进行质谱检测定量分析（图1A）。总共鉴定到了6753个蛋白，其中4354个蛋白有定量信息，有1793个蛋白质发生超过2倍的表达量变化（|log2(FC)| 1），表明在神经元分化过程中至少有1/3的神经元蛋白发生重构（图2B）。以Rattus norvegicus蛋白质数据库作为背景的富集分析结果显示，本次组学数据已涵盖了大鼠海马神经元大部分特异性蛋白（图1B），平均相对蛋白丰度跨越5个数量级（图1C），位于轴突和神经末梢的蛋白质是除常见的核小体蛋白质和蛋白酶体之外丰度最高的蛋白质。Pearson相关性分析表明本次实验生物学重复之间的相关性良好（图1D，图2A）。 图1 海马神经元发育分化定量蛋白质组学分析 图2 生物学重复性分析和差异蛋白分析 2. 神经元分化过程中蛋白质组动态变化 作者对定量到的4354个蛋白质在不同发育阶段表达量进行深入分析，表达量没有发生明显改变的蛋白质多参与生物过程，如翻译、蛋白分解代谢、蛋白酶体等（图2C），这说明在神经元分化期间蛋白质组重塑过程中全局蛋白质周转率基本上不受影响。 为了获得神经元分化过程中蛋白质组表达动态变化，作者对所有表达量显着变化的蛋白质进行表达模式聚类分析，发现有6种表达模式（图3A）。其中蛋白质在Cluster 1、2和3中的分化期间上调，在Cluster 4、5和6中的分化期间下调。此外，功能注释分析显示特定Cluster内许多蛋白在细胞成分、分子功能以及生物过程方面具有共同的特性（图3B）。Cluster6含有从DIV1到DIV5显著下调的蛋白质，参与早期神经元分化期间精确定时的下调，以细胞周期调控和DNA复制等多种蛋白为主（图3C），Cluster5中的蛋白随时间持续下调，富含与染色质相关的蛋白质，Cluster4中的蛋白质表现出从DIV5到DIV14的显著下调，该Cluster中的许多蛋白质与RNA代谢相关，Cluster3中的蛋白从DIV1到DIV5显著上调，其中许多蛋白质与细胞粘附和细胞信号相关，Cluster2中的蛋白从DIV1到DIV14一直在显著上调，主要是与阳离子传输和神经递质分泌有关的蛋白质，Cluster1中的蛋白从DIV5到DIV14显著上调，其中包含了参与多糖、氨基酸和脂类代谢在内的多种代谢过程的蛋白质。 图3 神经元分化过程中动态蛋白质组重塑 3. 神经元发育过程中的突触和细胞粘附蛋白质分析 作者随后研究突触发生过程中蛋白表达动态变化，这是神经元发育中的一个关键事件，需要协调组装高度连接的蛋白质网络，包括支架蛋白、受体及其下游靶标、信号分子和细胞粘附蛋白。培养期间海马神经元发育期间的突触形成发生在DIV5至第DIV14阶段，大多数差异表达的突触蛋白被分配到Cluster2，这表明从DIV1到DIV14的相对蛋白质水平稳定增加，这些蛋白多为参与囊泡运输（Syp、Syt1）、细胞骨架组织和蛋白质锚定（Cask、Pclo、Bsn）、神经递质释放（Syn1、Vamp2、Snap25、Sv2a、Sv2b）的重要突触前蛋白（图4C）。为了验证定量蛋白质组学数据，作者进行对应时间点的WB实验（图4G-I），证实了在后期发育阶段相应蛋白上调的表达水平。 细胞粘附分子是另一类重要的蛋白质，在神经元发育中起关键作用。它们介导轴突寻路和轴突-树突接触形成，并进一步调节树突棘形态和突触可塑性。在作者的组学数据集中定量了82种细胞粘附蛋白，包括Cntn1、NrCAM、Nrxn2、NCAM1和NCAM2等（图 4E），其中有 24个蛋白存在于Cluster3（图3A）。 图4 神经元分化过程中蛋白质表达的变化 4. 关键细胞粘附分子NCAM1 神经细胞粘附分子1（NCAM1）是细胞粘附蛋白的重要成员