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人参AG01基因克隆和序列研究 ［摘要］目的：从人参叶片中克隆Argonaute 1 (PgAGOl)的全长基因，并利用生物信息学方法进行分析。 方法：根据人参EST序列设计特异性引物，采用RACE 方法克隆PgAGOl的cDNA全长，并对PgAGO 1蛋白的结构进 行预测、氨基酸序列多重比对以及构建系统进化树等分析； 同时采用实时定量PCR检测PgAGOl基因在人参不同组织根、 茎、叶、花和愈伤中表达水平。 结果：克隆的PgAGOl全长cDNA为3 776 bp,其中包括 5’ UTR 204 bp, 3’ UTR 254 bp,基因内部包含完整的开放 阅读框，可编码1 105个氨基酸，预测蛋白质相对分子质量 为122. 22 kDa,理论等电点pl 9. 71；实时定量PCR检测结 果表明PgAGOl基因在人参花中的表达量最高，在根中最低。 结论：从人参叶片中克隆得到PgAGOl的全长cDNA,为 进一步研究该基因在人参组织发育中的调节作用打下基础。 ［关键词］人参；microRNA； Argonaute 1； RACE；生 物信息分析 MicroRNA (miRNA)是真核细胞内一类大小为20?24 nt 的内源性非编码单链小RNA,广泛分布于动植物体内，具有 高度保守性［1-3］ o在植物体内，miRNA通过调节靶基因来控 制植物根、茎、叶、花等的形态建成、细胞分化、疏导组织 形成以及植物对生物和非生物胁迫的响应，在植物生长、发 育和分化等过程中发挥非常重要的调控作用[2-6] o成熟的 miRNA通过与RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC)结合，形成具有切割活性的RNA 沉默复合物，再与靶基因互补配对来降解靶基因或抑制靶基 因的翻译[4, 6-7] o AGO蛋白作为RISC的核心，在小RNA沉 默通路中发挥关键作用。拟南芥AtAGOl是目前研究最为透 彻的、功能也最为重要的一个AGO蛋白[8-9],参与miRNA、 转录后基因沉默(PTGS)、病毒诱导的基因沉默(VIGS)或 抗病毒沉默和ta-siRNA等多个通路。目前，有关AGO蛋白 家族的功能和作用机制还未完全清楚，研究主要集中在拟南 芥和水稻等几种模式植物中，药用植物人参AGO基因的研究 未见报道。 本研究以人参叶片为材料，对PgAGOl进行克隆，得到 其cDNA全长序列3 776 bp；采用荧光实时定量PCR检测 PgAGOl基因在人参不同组织中的表达水平，为进一步研究该 基因的作用机制奠定基础。 1材料 ETC 811东胜PCR扩增仪,CFX96BI0-RAD荧光定量PCR 仪，BIO-RAD凝胶成像系统等；大肠杆菌DH5 a , TOP 10及 DNA快速凝胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；总RNA 提取及 RACE 试剂盒为 Invitrogen 产品；Poly (T) Adaptor RT-PCR试剂盒为Ambion产品；DNA提取试剂盒、质粒提取 试剂盒、pMD18-T Vector, Taq DNA 聚合酶、DNA Marker 及 实时定量PCR试剂盒购自大连宝生物工程公司；其他试剂为 国产分析纯，实验中所用的引物合成以及序列测定由北京三 博远志公司完成。 2方法 2.1人参叶片的取材本实验用于基因克隆的材料为石 柱参 Panax ginseng C. A. Meyer cv. Shizhu,于 2012 年 4 月中旬购自辽宁省丹东市宽甸镇石柱子村参场。经中国医学 科学院药用植物研究所人工气候室培育2周后对不同组织RT (root 根)，ST (stem 茎)，LE (leaf 叶)，FL (flower 花) 取材并迅速保存于液氮中。人参愈伤组织EC (embryogenic callus胚性愈伤)的诱导与取样见[11] o 2. 2 PgAGOl基因的全长克隆 采用Trizol方法抽提人参 叶片总RNA。总RNA的纯化及DNase I消化参照RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen)o 用 Oligotex 试剂盒纯化总 RNA, 获得 mRNA；根据 Invitrogen Gene Racer 试剂盒对 mRNA 进行去 磷酸化、去帽子结构、连接接头；用SuperScript III (Invitrogen)试剂盒进行反转录，合成cDNA第一链。根 据人参 EST 1 (Genbank： gb|HS077398. 1|)设计引物 AGOR1, AG0R2, AG0F1； EST 2 (FW1NBNE01A7WLY)设计引物 AG0R3, AG0F2； EST 3 (gb|DV555249. 1| )设计引物 AG0R4□ AG0R1, AG0R2分别用