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白术、苍术种子位点特异性PCR鉴别方法探 究 ［摘要］目的：筛选白术、苍术鉴别SNP位点，并 设计特异性引物，实现白术、苍术种子的快速鉴定。方法： 通过测序及GenBank中下载获得白术、苍术的psb A-trn H 序列，通过使用Bioedit软件比对获得SNP位点，设计位点 特异性PCR引物，将ITS通用引物加入到特异性引物构建多 重PCR体系，并优化PCR条件，对白术、苍术种子进行分子 鉴定。结果：构建了多重PCR鉴别体系，通过一个PCR反应, 能扩增出苍术、白术约643 bp的ITS DNA质控条带，扩增 出白术172 bp的特异性鉴别条带，实现白术、苍术鉴别。 结论：使用位点特异性PCR技术可以有效鉴别白术、苍术种 子。 ［关键词］白术；SNP；分子鉴定；种子 ［收稿日期］2013-02-28 ［基金项目］北京市科技专项“道地中药功能基因组北 京市重点实验室2012年阶梯计划项目” ［通信作者］*袁媛,E-mail： yuanyuan@icmm. ac. cn 中 药材白术是菊科 Compositae 植物 Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根茎，多为栽培品，主要产于 浙江、安徽、湖北、湖南、江西等省。种子繁殖是白术传统 的生产方法，但目前许多药材种子都是自留种或从药材市场 购买，种子缺少足够的检测检验标准和合格包装［1］,存在 不少陈旧种子、不完全成熟种子或伪品［2-3］,如何科学鉴 定中药材种子，建立中药材种子标准意义重大［4］。 白术与其近缘种苍术种子形态上很相似，在实际生产和 种子销售中容易混杂。苍术来源植物为茅苍术A. lancea或 北苍术A. chinensis ,据2010年版《中国药典》记载， 白术和苍术在功效上存在显著差异［5］,因此如何准确鉴别2 种药材的种子，保证白术种质来源、避免种源混杂，对保障 白术药材质量以及安全用药具有重要意义。 关于白术与苍术的鉴定研究已有报道［6-7］,但对于其 种子的来源鉴别研究鲜有报道。近年来，以分子生物学为基 础的检测方法被应用于药材鉴别中，特别是位点特异性PCR 可用于检测单个或多个位点的核昔酸变异，即可通过单个 PCR反应区分药材的真伪品，已成功用于藁本［8］、石斛［9］、 金银花［10］等中药材的真伪品鉴别。本文通过使用位点特异 性PCR技术，利用白术与苍术的SNP位点，实现2种药材种 子的分子鉴定，为白术种子质量标准制定提供参考。 1材料 白术种子于2011年购自于河北安国药市及2012年采自 湖南长沙，苍术于2011年采集自河南、湖北、山西、河北、 山东等地，材料来源及鉴定人见表1,凭证标本保存于中国 中医科学院中药资源中心。 2方法 2. 1 DNA提取 将干燥种子研磨成粉，取约0. 01 g粉末置于2. 0 mL的 微量离心管中，加入900 nL已灭菌的CTAB提取液(2% CTAB, 100 mmol - L-l Tris-HCl, 20 mmol - L-l EDTA, 1.4 mol - L-1 NaCl), 0.01 g PVP 40000, 10 uL B -疏基乙醇充分振荡 混匀，65 °C水浴1.0?1.5 h,期间轻摇2?3次。水浴结束 后取出，冷却至室温，加入900 nL酚-氯仿-异戊醇 (25 : 24 : 1),充分振荡混匀，12 000 Xg离心10 min。 取上清，加入等体积氯仿-异戊醇(24 : 1),充分振荡混匀， 12 000 Xg离心10 min。取上清，加入2/3体积预冷的异 丙醇溶液，-20 ￡放置0. 5 h以上。取出，12 000 Xg离 心10 min,弃上清，沉淀用70%乙醇洗涤2次，37 *挥干 乙醇，用适量灭菌水溶解，-20 °C保存。 2. 2引物设计 选择通用引物psb A-trnH对白术、苍术样品进行PCR 扩增并测序，获得 BZ1-BZ10, MCZ1 ?MCZ10, BCZ1-BCZ20 等40条序列；并于搜索 表1试验材料 Table 1 Plant samples GenBank数据库中苍术属Atractylodes的DNA序列信 息，获得 2 条 A. lancea 的 psb A-trn H 序列(GU724247. 1； GQ435071. 1),对所有白术、苍术序列进行多重比对，筛选 获得SNP位点1个，为第175 (A/T)位点，通过该位点设计 白术鉴别引物，引物设定参照相关方法进行，并引入错配 [11] o同时使用ITS通用引物作为质控引物用于评价样品DNA 的质量，见表2。 表2引物序列 Table 2 Primers in this paper 注：R1引物“-3’ ”端第二位“G”为错配碱基。 2. 3 PCR扩增 2. 3.