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白脉散有效成分组调控神经干细胞增殖实 验探究 ［摘要］神经干细胞(NSCs)具有替代及修复受损神 经组织的作用，研究发现能够通过调控NSCs内环境诱导其 增殖分化，重塑神经功能，从而修复脑卒中神经病变等神经 系统损伤。本实验研究了蒙药白脉散有效成分组(BMECG) 激活NSCs增殖的药理学作用。通过建立体内外2种损伤模 型，模拟脑卒中神经病变，分别利用流式细胞术、行为学检 测、Nestin免疫组化等方法研究BMECG的脑保护作用机制。 结果表明，BMECG能够显著提高体外培养NSCs增殖能力，有 助于小鼠的行为学功能恢复，明显改善模型小鼠大脑皮层 NSCs增殖能力。因此BMECG直接针对NSCs增殖存活能力发 挥作用，可能是治疗脑卒中神经病变的机制之一，该药物具 有重要的研究意义和广阔的应用前景。 ［关键词］白脉散；有效成分组；神经干细胞；脑卒中; 竣基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯染色法 ［收稿日期］2013-04-18 ［基金项目］国家自然科学基金面上项目 ［通信作者］*陈小玉，E-mail： xiaoyu0767@163、com ［作者简介］刘庆山，Tel/Fax： (010 E-mail： nlqsh@163 com “有效成分组是指复方中与治疗目的密 切相关的活性成分的总和，是传统复方现代化的重要指导理 论之一 [1]。白脉散有效成分组（Baimai effective compounds group, BMECG）是课题组在“复方有效成分组 理论指导下从蒙药经典方剂白脉散中获得的“组分中药”， 由人参皂昔血1、胡黄连昔II、牛磺酸等组成，成分清楚， 质量可控[2-3] o白脉散源自《四部医典》，临床可用于治疗 白脉病等病症[4],为发挥民族药大复方多组分、多靶点的 特点，对其有效成分进行深入研究，研究BMECG对脑卒中神 经病变的作用和机制，本研究釆用体外实验及整体实验，对 BMECG影响NSCs的作用进行了研究。 1材料 1、1动物 一日龄Wistar大鼠，SPF级，购自北京维通利华有限公 司，许可证号SCXK （京）2006-0008；健康雄性昆明小鼠， SPF级，体重（20±2） g,购自北京维通利华有限公司，许 可证号 SCXK （京）2009-0017o 1、2药品 人参皂昔Rgl（纯度98%,昆明双星科技开发有限公司）, 胡黄连昔II （纯度90%,南京景竹生物科技公司），白脉散有 效成分组为本实验室自制，由人参皂昔Rgl、没食子酸、胡 黄连昔II、牛磺酸等成分按照质量百分比33%, 30%, 33%, 4%组成。 1、3试剂 胎牛血清（澳大利亚进口，浙江天航生物科技有限公司 分装）；DMEM/F12培养基、神经干细胞培养添加剂B27 （Gibco 公司）；重组牛碱性成纤维生长因子bFGF （珠海亿胜生物制 药有限公司）;MAP-2兔抗鼠一抗、Nest in兔抗鼠一抗（Sigma 公司）；CFDA-SE试剂盒（碧云天生物技术研究所）；FITC标 记山羊抗兔二抗（北京中衫金桥生物技术有限公司）；DAB显 色试剂盒、Mayor苏木素（武汉博士德生物工程有限公司）； 辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG （碧云天生物技术研究 所）；其余试剂均为市售分析纯。 1、 4仪器 ZB-200平衡转棒仪（成都泰盟软件有限公司）；超净工 作台（北京医疗设备厂）；CB150二氧化碳培养箱（德国 Binder）； HERAcell 150 三气培养箱（美国 Thermo 公司）； 流式细胞仪（FACSCalibur, BD公司，美国）；1X81自动型 倒置荧光显微镜（日本0lympus公司）；5804R型低速冷冻离 心机（德国艾本德公司）。 2方法 2、 1体外NSCs氧糖剥夺/复供增殖模型的制备 2、1、1原代培养大鼠NSCs取一日龄新生大鼠，以75% 乙醇浸泡灭菌，置于无菌工作台中冰上操作。取出大脑皮层 置于4 °CPBS中，剥离血管和脑膜后置于小西林瓶中加2 mL 培养基剪成泥状，用吹打法分散细胞，200目钢筛过滤。1 000 r ? min-1离心5 min,弃上清，加入DMEM/F12完全培养基 （含 bFGF 50 ug - L-l, 2%B27）,吹打成细胞悬液。0、4% 台盼蓝计数，调整细胞密度，按5X105个/mL接种于25 cm2 细胞培养瓶中。置于37 °C, 5%CO2培养箱中悬浮培养，待 NSCs形成克隆球后适时传代［5］。首先利用NSCs特异性表面 标记物巢蛋白（Nestin）按常规免疫荧光实验方法进行鉴定。 给药后每天选取6个不同视野，在倒置显微镜下拍照，最后 应用Image-Pro-Plus 6、0软件进行处理，观察克隆球数目 变化及直径计算其增殖能力。 培养