白花蛇舌草总黄酮对实验性溃疡性结肠炎作用和免疫学机制探究.docxVIP

白花蛇舌草总黄酮对实验性溃疡性结肠炎 作用和免疫学机制探究 ［摘要］目的：观察不同剂量白花蛇舌草总黄酮 (FOD)对溃疡性结肠炎(UC)模型小鼠结肠NF-kB及IL-8, TNF-a , IL-10表达的影响，探讨其抗UC的免疫学机制。方 法：60只雄性昆明小鼠随机分成6组：对照组(Cont)蒸馆 水灌胃，其余5组均自由饮用4%右旋葡聚糖硫酸钠(DSS) 水溶液7 d以造成急性UC,同时给予下列药物灌胃：蒸億水 (DSS 组)，柳氮磺胺毗噪(SASP ) 500 mg? kg-1 - d-1 (DSS+SASP 组)，FOD 60 mg ? kg-1 ? d-1 (DSS+FOD-H 组)， FOD 40 mg ? kg-1 ? d-1 ( DSS+FOD-M 组)，FOD 26. 7 mg?kg-l?d-1 (DSS+FOD-L组)。造模给药期间，每天对各 组小鼠进行疾病活动指数(DAI)评分。造模7 d后处死小 鼠，取结肠组织标本，对结肠黏膜进行病理组织学损伤评估; 用免疫组化法检测NF- k B p65的表达，ELISA法检测结肠组 织中IL-8, TNF-a及ILT0的表达。结果：自由饮用4%DSS 水溶液7 d可成功造成小鼠急性UC,与对照组比较，DSS组 小鼠的DAI、结肠病理组织学损伤评分明显上升，结肠组织 中NF- k B p65及IL-8, TNF-a表达显著增多，IL-10表达 明显降低(P 2方法 2. 1 UC小鼠模型的建立 根据Cooper等［7］的方法建立小鼠溃疡性结肠炎模型：将40 g DSS溶于饮用水中配成4%DSS 溶液，代替其日常饮用水给予昆明小鼠自由饮用连续7d, 7 d后UC小鼠模型的造模成功率为100%o 2.2分组及给药 取60只雄性昆明小鼠，将小鼠体重应 用SPSS 13.0统计软件随机设计分成6组，每组10只。即 对照组(Cont).DSS模型组(DSS组)，SASP治疗组(DSS+SASP 组)，F0D高剂量组(DSS+F0D-H组)，F0D中剂量组(DSS+F0D-M 组)，F0D低剂量组(DSS+F0D-L组)。除Cont蒸馆水灌胃, 其余5组均自由饮用4%DSS水溶液7d以造成急性UC,同时 给予下列药物灌蒸憎水 给予下列药物灌 蒸憎水(DSS 组)，SASP 500 mg ? kg~l ? d~l ( DSS+SASP 组)，FOD 60 mg ? kg-1 ? d~l (DSS+FOD-H 组)，FOD 40 mg ? kg-1 ? d-1 (DSS+FOD-M 组)， FOD 26. 7 mg ? kg-1 ? d-1 (DSS+FOD-L 组)，每天 1 次，连续 7 do 7 d后随即抽取对照组和模型组小鼠各2只，处死， 取结肠标本作病理检查，以确定造模成功。 2. 3结肠炎症的观察指标和检测方法疾病活动指数 (DAI)的评估：每日观察小鼠的体重、大便性状和隐血情 况(联苯胺法检测)，参照文献［7］评分标准：DAI=(体重下 降分数+大便性状分数+便血分数)/3,对各组小鼠进行DAI 评分，以评估疾病活动情况。具体评分如下：体重下降百分 率(体重不变为0, 1?5为1分，5?10为2分，10?15为 3分，大于15为4分)、大便性状(正常为0,松散的大便 为2分，腹泻为4分）和大便隐血（正常0分，隐血阳性为 2分，显性出血为4分）。 病理组织学损伤的评估：实验结束后处死小鼠，取出结 肠沿肠系膜缘纵行剪开，冷生理盐水冲洗干净，滤纸吸干， 进行肉眼大体形态和组织学形态评分分级，截取病变明显处 结肠组织约1.0 cm置于4%甲醛溶液中4 °C固定过夜，常规 组织脱水、石蜡包埋、切片，HE染色，光镜下观察结肠组织 病理损伤。 结肠组织损伤大体形态和组织学形态评分方法：大体形 态损伤评分指标包括粘连、局部充血、溃疡及炎症。粘连及 充血按有无及轻重分别计0, 1, 2分，出现炎症、溃疡数目 增加1个、溃疡面＞2 cm时，范围每增加1 cm计分均加1。 组织学指标包括溃疡、炎症、肉芽肿、纤维化及病变深度， 按有无及轻重分别计0, 1, 2分，病变深度达黏膜下层、肌 层、浆膜层分别计1, 2, 3分，各项相加得总分［8］。 结肠组织中核因子NF-kB表达的检测：取上述的石蜡 切片，按照试剂盒说明书进行免疫组化染色检测NF- k B p65 表达。NF-KBp65阳性细胞主要为黏膜细胞、巨噬细胞、单 核细胞，阳性细胞胞质和胞核内均有棕色颗粒，以胞核为主。 采用图像分析技术，计数镜下单位面积（1 mmXl mm）内的 平均阳性细胞数量。 结肠组织中细胞因子TNF- a , IL-8, ILT0含量检测： 采用ELISA法检测结肠组织匀浆中促炎细胞因子TNF- a , IL-8和