血涂片制备与染色.docVIP

血涂片制备与染色 一、血涂片制备 【器材】 清洁、干燥、无尘、无油脂的载玻片(25 mm x75 mm ，厚度为0.8- 1.2mm) 。 【操作】 血涂片制备方法很多，目前临床实验室普遍采用的是手工推片法，在玻片近端 1/3 处，加一滴(约 0.05 ml) 充分混匀的血液，握住另一张边缘光滑的推片，以 30°- 45°角使血滴沿推片迅速散开，快速、平稳地推动推片至载玻片的另一端。 【附注】 1. 血涂片通常呈舌状或楔形，分头、体、尾三部分。 2. 推好的血涂片应在空气中晃动，使其尽快干燥。天气寒冷或潮湿时，应于37℃ 3. 涂片的厚薄、长度与血滴的大小、推片与载玻片之间的角度、推片时的速度及红细胞比容有关。一般认为血滴大、角度大、速度快则血膜厚;反之则血膜薄。红细胞比容高于正常时，血液黏度较高，保持较小的角度，可得满意结果;相反，红细胞比容低于正常时，血液较稀，则应用较大角度、推片速度应较快。 4. 血涂片应在 1 h 内染色或在 1 h 内用无水甲醇(含水量 3% )固定后染色。 5. 新购置的载破片常带有游离碱质，必须用浓度约 1 mol/LHCL浸泡 24 h 后，再用清水彻底冲洗，擦干后备用。用过的载玻片可放人含适量肥皂或其他洗涤剂的清水中煮沸 20 min ，洗净，再用清水反复冲洗，蒸馆水最后浸洗，擦干备用。使用时，切勿用手触及玻片表面。 二、 血涂片染色 (一)瑞氏( Wright) 染色法 【原理】 瑞氏染色法使细胞着色既有化学亲和反应，又有物理吸附作用。各种细胞由于其所含化学成分不同，对染料的亲合力也不一样，因此，染色后各种细胞呈现出各自的染色特点。 【试剂】 1.瑞氏染液 (1)瑞氏染料 0.1 g (2)甲醇 (AR) 60.0 ml 。 瑞氏染料由酸性染料伊红和碱性染料美蓝的氧化物(天青)组成。将瑞氏染料放人清洁干燥研钵里，先加少量甲醇，充分研磨使染料溶解，将己溶解的染料倒人棕色试剂瓶中，未溶解的再加少量甲醇研磨，直至染料完全溶解，甲醇全部用完为止。配好后放于室温下，一周后即可使用。新配染液效果较差，放置时间延长，染色效果越好。久置应密封，以免甲醇挥发或氧化成甲酸。染液中也可加中性甘油 2-3 ml ，除可防止甲醇过早挥发外，也可使细胞着色清晰。 2. pH 6. 8 磷酸盐缓冲液 磷酸二氢钾 (KH2P04 ) 0.3 g 磷酸氢二钠 (Na2HP04) 0.2 g 加少量蒸馏水溶解，再加至 1000 ml 。 【操作】 1. 采血后推制厚薄适宜的血涂片(见“血涂片制备”)。 2. 用蜡笔在血膜两头画线，然后将血涂片平放在染色架上。 3. 加瑞氏染液数滴，以覆盖整个血膜为宜，固定血膜约 1 min。 4. 滴加约等量的缓冲液与染液混合，室温下染色 5-10 min。 5. 用流水冲去染液，待干燥后镜检。 【附注】 1. pH 对细胞染色有影响。由于细胞中各种蛋白质均为两性电解质，所带电荷随溶液 pH 而定。对某-蛋白质而言，如环境 pH pI( 蛋白质的等电点) ，则该蛋白质带正电荷，即在酸性环境中正电荷增多.易与酸性伊红结合，染色偏红;相反，则易与美蓝天青结合，染色偏蓝。为此，应使用清洁中性的载玻片，稀释染液必须用 pH 6.8 缓冲液。冲洗破片必须用流水。 2. 未干透的血膜不能染色，否则染色时血膜易脱落。 3. 染色时间与染液浓度、染色时温度成反比；而与细胞数量成正比。 4. 冲洗时不能先倒掉染液，应用流水冲去，以防染料沉淀在血膜上。 5. 如血膜上有染料颗粒沉积，可加少许甲醇溶解，但需立即用水冲掉甲醇，以免脱色。 6. 染色过谈，可以复染。复染时应先加缓冲液，创造良好的染色环境， 而后加染液，或加染液与缓冲液的混合液，不可先加染液。 7. 染色过深可用水冲洗或浸泡水中一定时间，也可用甲醇脱色。 8. 染色偏酸或偏碱时，均应更换缓冲液再重染。 9. 瑞氏染液的质量好坏除用血涂片实际染色效果评价外，还可采用吸光度比值 (ratio of absorp-tion , RA )评价。瑞氏染液的成熟指数以 RA(A650nm/A525nm)=1.3±O.1为宜。 10. 目前已有商品化瑞氏染液及缓冲液供应。 (二)瑞氏-姬姆萨(Wright-Giemsa)复合染色法 姬姆萨染色原理与瑞氏染色相同，但提高了噻嗪染料的质量，加强了天青的作用，对细胞核着色效果较好，但对中性颗粒着色较瑞氏染色差。因此，瑞氏-姬姆萨复合染色法可取长补短，使血细胞的颗粒及胞核均能获得满意的染色放果。 【试