鳜鱼蛋白酶激活受体1和2基因的克隆和表达谱分析-水生生物学专业论文.docxVIP

中山大学硕士学位论文 中山大学硕士学位论文 霍伟立 中文摘要 鳜鱼蛋白酶激活受体1和2基因的克隆和表达谱分析 硕士生：霍伟立 导师：何建国教授 鳜鱼(Sini[7010a ehuatsi)是原产我国的淡水肉食鱼类，具有较大经济价 值，已经成为我国重要的养殖品种。鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus，IsKNv)是近年广东鳜鱼养殖业爆发性流 行病的主要病因之一，造成重大经济损失。ISKNV以鳜鱼脾和肾为主要攻击目标， 引起脾肾细胞的肿大和坏死。 在ISKNV感染鳜鱼的抑制性消减杂交文库中找到了胰蛋白酶(trypsin)、凝 血因子X(coagulation factor X，FX)等多种丝氨酸蛋白酶基因。为了研究 宿主和病毒之间的相互作用，通过设计简并引物，在鱼类中首次克隆得到了丝氨 酸蛋白酶的重要受体——蛋白酶激活受体1和2[protease—activated receptor l／2，PARl／2。官方名称分别为coagulation factor II(thrombin)receptor 和coagulation factor II(thrombin)receptor like l，f2r和f2r11。本文沿 用文献中更广泛使用的PAR]的表达序列标签(expression sequence tag，EST)。 通过快速扩增cDNA末端(rapid amplification of cDNA ends，RAcE)技 术，克隆得到了PARl全长cDNA序列和PAR2的整个开放阅读框(open reading frame，ORF)。生物信息学预测两个受体均为七次跨膜的G蛋白偶联受体 (G—protein coupled receptor，GPCR)。PARl的开放阅读框编码428个氨基 酸的蛋白质，前20个氨基酸为信号肽；PAR2的cDNA的开放阅读框编码385个 氨基酸的蛋白质，前21个氨基酸为信号肽。 以基因组DNA为模板，扩增、测序得到了PARl和2的基因结构。PARl基因 由两个外显子和一个内含子组成，内含子长1396bp。PAR2基因也由两个外显子 T 中山大学硕士学位论文 中山大学硕士学位论文 霍伟立 和一个内含子组成，内含子长655bp。 通过构建系统进化树，显示鳜鱼PARl和PAR2两个受体分别与高等脊椎动物 的PARI和PAR2聚类在一起，表明两个受体在鱼类以前已经出现分化。 应用实时定量PCR技术，分析了两个受体在健康鳜鱼中的组织器官分布和在 感染ISKNV不同时段各免疫器官及血中的时空表达情况。 组织器官分布显示：PARl广泛分布，在脾、血、脑、头肾、心中表达较多， 后肾、肝、鳃、肠中相对略少，肌肉基本不表达；PAR2在鳃、肠和后肾中表达 量远大于其他组织器官。 PARl的时空表达情况显示：头肾、后肾和脾在感染过程中PARl表达量变化 不太明显；血中感染后第4天PARl表达量大幅提高，第7天迅速下降到静息水 平，感染后期和第7天比较变化不大。 PAR2的时空表达情况显示：头肾和血在感染后第4天PAR2表达量大幅上调， 第7天下降到接近静息水平，其后和第7天比较变化不大；脾中表达量在经过第 4天略微下调后，第7天大幅上调，第10天表达量下降到接近静息水平，第15 天表达量和第10天接近；后肾中在感染后PAR2表达被下调，然后缓慢恢复，第 15天恢复到接近静息水平。 【关键词】：感染性脾肾坏死病毒；蛋白酶激活受体；简并引物：快速扩增cDNA 末端；荧光实时定量一PCR n 中thX掣：硕士学位论文 中thX掣：硕士学位论文 霍伟立 ABSTI己ACT Molecular Cloning，Expression Analysis of Protease-activated Receptor 1 and 2 Genes from Siniperca chuatsf MajorAquatic Biology Name：HuO Wbili Supervisor：Prof．He Jianguo Mandarin Hsh(Siniperca chuatsi)has become an important aquatic product in China in the past decade．Infectious spleen and kidney necrosis virus(IsⅪ叮v)targets spleen，head kidney and kidney of mandarin fish，and causes cell necrosis in these organs．ISKNV Was responsible for the s