冠状病毒假病毒系统的构建及其在受体识别中的应用-预防兽医学专业论文.docxVIP

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书学位论文 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 否 如需保密，解密时间 年 月 日 是否保密 独创性声明 I恻嬲渺 本人声睨所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证-I瞎 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名： 王良良 时闻： ZoI占# 占月／铲日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，为存在馆际合作关系的兄弟高校用户提供文献传递和交换服务，同时 本人保留在其他媒体发表论文的权力。 注：保密学位论文(即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文)在解密后适用于本授权-1旨。 学位论文作者签名：京王承承癣香导师签名r1歹≯仍 签名目期： 矽f16年参月#／-日 签名日期： --如ff,年 ∥月／争日 万方数据 冠状病毒假病毒系统的构建及其在受体识别中的应用目 冠状病毒假病毒系统的构建及其在受体识别中的应用 目 录 摘要 ．i Abstract．．．．．．．． ．．．．． ．．．．．．． ．．．．．．． ．．．．．．．． ．． ． ． ．．．iii 缩略语表(Abbreviation) v 1文献综述 1 1．1冠状病毒流行病学 ．1 1．2冠状病毒病原学特性 ．2 1．3冠状病毒S蛋白 ．2 1．4冠状病毒与宿主受体 ．3 1．5假病毒系统 ．5 1．5．1假病毒 ．．5 1．5．2水疱性口炎病毒 ．．5 1．5．3 VSV-AG假病毒系统 5 1．5．4慢病毒载体 一6 1．6荧光素酶报告基因 ．6 1．7 PCR技术 ．6 1．8免疫荧光技术 ．7 1．9蛋白免疫印迹法 ．7 2研究目的及意义 7 3材料与方法 9 3．1实验材料 ．9 3．1．1毒株、细胞与质粒 一9 3．1．2主要药品及试剂 一9 3．1．3主要试剂配制 一9 3．1．3．1细胞培养相关试剂 9 3．1．3．2细菌培养相关试剂 ．10 3．1．3．3 Western blot相关试剂 10 3．1．3．4 IFA相关试剂 ．．11 3．1．4实验所用引物 1 l 3．2实验方法 12 3．2．1细胞传代培养 12 3．2．2基因克隆以及质粒构建 13 3．2．2．1目的基因的PCR扩增 13 3．2。2．2 PCR产物的电泳与回收 ．13 3．2．2．3 DNA片段和载体的酶切 ．14 3．2．2．4外源DNA片段与载体的连接反应 15 3．2．2．5外源DNA片段与载体的重组反应 15 3．2．2．6大肠杆菌感受态的制备(氯化钙法) ．15 3．2．2．7连接产物的转化 ．16 万方数据 华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文3．2．2．8重组质粒的提取 华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文 3．2．2．8重组质粒的提取 ．16 3．2．2．9重组质粒的鉴定 。17 3．2．3脂质体转染细胞的方法 17 3．2．4 Western Blot检测s蛋白的表达 ．．18 3．2．5痘病毒(vTF7．3)的扩增 ．．18 3．2．6 PEDV和TGEV的扩增 19 3．2．7病毒滴度的测定 ．19 3．2．8 VSV感染性克隆 19 3．2．9 VSV-AG假病毒的构建 ．20 3。2．10 VSv-△G-S假病毒的构建 20 3．2．1 1慢病毒假病毒系统构建冠状病毒s蛋白假病毒 一21 3．2．12荧光素酶报告基因试剂盒检测 ．．21 3．2．13 IFA检测病毒的细胞嗜性 21 3．2．14统计学分析 ．．22 4结果与分析 ～23 4．1 VSV感染性克隆 23 4．2 VSv-△G—S假病毒的构建 24 4．2．1构建pVSVFLAG．eGFP重组质粒 24 4．2．2 VSV-AG假病毒构建 ．25 4．2．3 VSV-AG假病毒的扩增及滴度测定 ．26 4．3冠状病毒S蛋白重组质粒的构建及表达 26 4。3．1 S蛋白重组质粒的构建 ．26 4．3．1．1 PCR扩增目的片段 ．26 4．3．1．2重组质粒的鉴定 ．27 4．3．2冠状病毒S蛋白在细胞中的表达 29 4．4冠状病毒s