低强度超声联合iPSCs源性神经嵴干细胞对周围神经损伤修复的作用.docVIP

PAGE / NUMPAGES 低强度超声联合iPSCs源性神经嵴干细胞对周围神经损伤修复的作用 摘 要 目前周围神经损伤在人群中发病率较高，在世界范围内影响着超过百万人的生活状态。压迫、撕裂等外伤或局部缺血等因素都可能引起神经系统部分或全部损伤，从而引起运动、感觉和自主功能的丧失，甚至神经元死亡。随着科学技术的发展，多种治疗方法的使用使得周围神经损伤的修复效果得到明显的提高，但离神经系统真正的形态和功能重建还相差甚远，因此急需一种有效且无副作用的治疗方法用于周围神经损伤的修复。在课题组前期研究基础上，本文以诱导性多潜能干细胞源性神经嵴干细胞(induced pluripotent stem cells derived neural crest stem cells, iPSCs-NCSCs)为种子细胞，以聚左旋乳酸(poly(L-lactic acid), PLLA)为材料制备组织工程神经导管，联合低强度超声(low intensity pulsed ultrasound, LIPUS)刺激，以大鼠坐骨神经断裂为模型，在体探索LIPUS联合iPSCs-NCSCs对周围神经损伤修复的作用，重点考察了LIPUS联合iPSCs-NCSCs对周围神经损伤之后坐骨神经功能指数(sciatic function index, SFI)、静态坐骨神经功能指数(static sciatic index, SSI)、坐骨神经传导速度(nerve conduct velocity, NCV)以及组织形态学方面功能恢复的影响。主要研究工作和实验结果如下： 组织工程神经导管的制备 通过电纺技术制备PLLA纳米纤维支架，分别利用场发射环境扫描电镜(field emission scanning electron microscope, FESEM)和Image-Pro Plus测定支架表面特征和计算纤维直径、利用INSTRON-E1000拉伸机测定PLLA导管的力学性能，以及LIVE/DEAD试剂盒检测PLLA组织工程神经导管中iPSCs-NCSCs的活性。结果显示所得PLLA纳米纤维呈现出较好的纵向排列性，其直径为251.65±59.37 nm，PLLA神经导管的弹性模量为34.49±0.47 MPa，抗拉强度为1.86±0.21 MPa，并且PLLA神经组织导管中细胞存活率超过95%。 LIPUS联合iPSCs-NCSC对周围神经损伤修复的影响 20只200-250 g的SD大鼠用于建立坐骨神经缺损10 mm动物模型。实验共分成五组，包括自体移植组(标记为Autograft)、PLLA空导管组(标记为C)、PLLA空导管联合低强度超声组(标记为C/LIPUS)、PLLA导管植入iPSCs-NCSC细胞组(标记为C/iPSCs)以及PLLA导管植入iPSCs-NCSC细胞并联合低强度超声组(标记为C/iPSCs/LIPUS)，其中Autograft组为对照组。 超声刺激处理时实现固定频率(1 MHz)、占空比(Duty cycle) (20%)、脉冲重复频率(Pulse repetition frequency, PRF) (100 Hz)的体外辐射，其强度为0.3 W/cm2，每次刺激时间为5分钟，共持续2周。分别通过术后大体观察，术后一个月和三个月的SFI、SSI检测，术后三个月的NCV检测以及形态学组织学检测以分析LIPUS联合种子细胞iPSCs-NCSCs对周围神经损伤修复的影响。 大体观察发现，术后一个月观察患趾伤口发现偶有溃烂，术侧肌肉萎缩严重，饮食、自由活动状况良好；三个月无溃烂发生，饮食、自由活动状况良好，肌肉萎缩较轻，术后三月解剖发现无明显炎症反应。术后一个月和三个月的SFI、SSI以及NCV结果显示，各实验组的功能恢复效果较自体移植组差(P0.05)，但C/iPSCs/LIPUS组的SFI，SSI，NCV值均明显高于其他三个实验组，另外，同等条件下，添加超声的实验组比未添加超声组的实验组神经修复效果较好。 Hematoxylin/eosin (HE)和 Bielschowsky神经纤维染色等组织学检测发现Autograft组与C/iPSCs/LIPUS组中，新生成的血管数量较多且再生神经纤维的密度较其他实验组大。另外，在同等条件下，但添加超声的实验组与未添加超声的实验组相比，其新生的血管和神经纤维较多。S100β免疫荧光结果显示，与C组、C/LIPUS组相比，Autograft组与C/iPSCs/LIPUS组表达出较多的施旺细胞(Schwann cells, SCs)标记物。 本文的研究结果表明强度为0.3 W/cm2的LIPUS联合iPSCs-NCSCs对周围神经损伤的修复有一定的治疗作用，对于探索高效周围神经损伤修复方