密码子优化后的柞蚕溶菌酶基因在酵母中的表达及活性测定-生物工程专业毕业论文.docxVIP

研究生优秀毕业论文 大连理_T大学专业学位硕士学位论文IIII)1 大连理_T大学专业学位硕士学位论文 IIII)1 IIIII II II llllll IUlll IIl— Y2820622 摘 要 溶菌酶(Lysozyme)，又称为胞壁质酶或N一乙酰胞壁质聚糖水解酶，是天然免疫的重 要分子之一。它可以专一性的作用于微生物的细胞壁，主要通过破坏肽聚糖中的N一乙 酰氨基葡糖胺(NAG)和N．乙酰胞壁酸(NAM)之问的B．1，4糖苷键，从而使细胞壁内的不 溶性的黏多糖分解成为可溶性的糖肽，进而致使细胞壁破裂或溶解，内容物逸出从而达 到抑制菌体生长或杀灭菌体的作用。因此，溶菌酶在大多数生物体生物防御方面具有重 要作用。此外，在无脊椎动物中，溶菌酶可以作为一种重要的消化酶，通过分解细菌， 产生的C元素和N元素还可以供无脊椎动物生长。溶菌酶还能够直接与带有负电荷的 病毒蛋白相结合，可以与RNA、DNA、脱辅基蛋白形成复盐，从而导致病毒失去活性。 溶菌酶还有许多其他功能，包括生殖、生长刺激、抗病毒、免疫调节、抗炎和抗肿瘤。 因此，溶菌酶被广泛的应用在饲料、食品、临床医学、生物学等领域。目前市场上所售 的溶菌酶绝大多数是从蛋清中提取的蛋清溶菌酶，溶菌酶传统的分离纯化方法是采用结 晶法，收率较低，且原料无法回收利用，这种现状限制了溶菌酶应用和产业的发展。 柞蚕是我国特有的一种经济昆虫，诱导后体内会产生多种抗性成分，溶菌酶就是其 中之一。柞蚕溶菌酶与蛋清溶菌酶同属于C型溶菌酶，其成熟肽含有120个氨基酸，预 测分子量为13987．8 Da，含有4个二硫键，活性中心由Glu32和Asp50构成。为了提高 柞蚕溶菌酶的表达量，本研究根据毕赤酵母偏爱的密码子，对柞蚕溶菌酶密码子进行了 优化，利用人工合成的方法获得目的基因，并且在基因的3’端加上6个组氨酸标签。构 建了柞蚕溶菌酶的毕赤酵母表达系统，实现了柞蚕溶菌酶的分泌表达，采用镍柱亲和层 析进行分离纯化，同时分析了柞蚕溶菌酶抑菌活性。优化了在2．5 L发酵罐内诱导时间、 诱导温度、培养基pH及甲醇浓度四个重要因素对柞蚕溶菌酶表达量的影响，从而确定 最优培养条件为：诱导发酵96h、诱导温度25℃、培养基pH7．0和每隔24h添加O．75％(v／v) 甲醇，表达量最高达到了2．4 g几，酶活达到22354 U／mg。通过琼脂扩散方法测定了柞 蚕溶菌酶对溶壁微球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、苍白杆菌及过氧 化醋杆菌均具有一定的抑菌作用。最后研究了柞蚕溶菌酶的最适作用温度和pH，表明 柞蚕溶菌酶具有一定的温度和酸碱耐受性，这些结论都证明了柞蚕溶菌酶是一种可以被 广泛应用的溶菌酶。 关键词：柞蚕溶菌酶；密码子优化；毕赤酵母；抑菌活性 万方数据 密码子优化后的柞蚕溶菌酶基冈在酵母I}1的表达及活性测定Expression 密码子优化后的柞蚕溶菌酶基冈在酵母I}1的表达及活性测定 Expression and activity determination of codon optimized Antheraea pernyi lysozyme gene in Pichia pastoris Abstract Lysozyme，also known as muramidase or N—acet)7lmuramide glycanohydrlase，as a defensive effector in innate immunity，plays all important role in combating microbial infections by rupturing the B·1，4-glycosidic bond between the alternating N—acetyl muramic acid and N·acetyl glucosamine residuals in bacterial peptidoglycan，the major bacterial cell wall polymer，thus damaging cell wall and causing bacterial cell lysis．Therefore，lysozyme plays a crucial role in the defense system of the most biological organism．In addition， Lysozyme carl be used as a kind of important digestive enzyme for the growth of invertebrates by C and N elemems decomposition bacte