基因组编辑新技术对猪CCR5基因的靶向作用-临床兽医学专业论文.docxVIP

上海海洋大学硕士学位论文 答辩委员会成员名单 姓名 工作单位 职称 备注 李家乐 上海海洋大学 教授 主席 刘惠莉 上海市农业科学院 研究员 委员 易建中 上海市农业科学院 研究员 委员 俞菊生 上海市农业科学院 研究员 委员 孙晓梅 上海市农业科学院 助理研究员 秘书 答辩地点 上海市农业科学院 答辩日期 2015.6.5 I I 基因组编辑新技术对猪 CCR5 基因的靶向作用 摘 要 动物基因组编辑技术是指研究人员能够依照特定的目的去修饰动物的遗传组成， 这是一项综合性的并且富有挑战性的技术。该技术由于能够比较容易并且精确的对基 因组进行 DNA 的添加、删除和置换的操作，使得其在改良畜产品质量，提高生产性 能，研究疾病模型，研发生物医药产品等方面都显示出广阔的应用前景。基因定点敲 入时，需要为一些外源基因，如报告基因、自杀基因、筛选基因、治疗性基因和外源 性优良性状基因提供一个安全可靠的停泊“港口”，在这些“港口”外源基因既可稳 定高效表达，又对细胞和组织无已知的副作用。近年来，转基因动物的生物安全性一 直是人们讨论的热点问题。从目前已经已发表的文献看来，针对猪基因组安全港位点 的研究凤毛麟角。因此，寻找合适的安全港位点对于转基因猪的制备显得尤为重要。 在克隆动物的制备中，耳成纤维细胞作为供核体细胞具有取材简便，成本低，对 动物生长影响小等优点，并且从耳部组织的采样能够实现活体取样，从而为优良猪种 的保种育种奠定基础。本研究第一部分采用组织块培养法分离、培养并建立猪耳成纤 维细胞系，然后用电转染的方法将质粒 pEGFP-C1 导入该细胞系，探索并优化其最适 条件和参数。最后成功建立上海白猪耳成纤维细胞系。电转后经过对各组转染效果的 观察，发现在 DNA 量为 20 ng，电压为 150 V，电阻为 500 Ω，电容为 500 μF 的条件 下进行电转，并且电转后经 37℃孵育，其效果最好。 第二部分为了研究 CCR5 基因作为安全港基因的可能性，首先分析了 CCR5 基因 序列，发现该基因位于猪基因组第 13 号染色体上，基因总长 4 565 bp，CDS 区位于第 二外显子上。然后针对 CDS 区 atg 下游约 110 bp 处分别设计并成功构建了 TALEN 和 CRISPR/Cas9 系统的打靶载体，并将其分别电转染猪耳成纤维细胞。然后用 CruiseTM 酶对细胞池进行酶切验证后，发现 TALEN 打靶 CCR5 基因 CDS 区的结果为阴性， CRISPR 的 pool 验证显示敲除效率很低。初步怀疑这两种技术在该位点上进行打靶可 能存在的脱靶效应。 II II 第 三 部 分 为 检 测 分 析 上 海 梅 山 猪 封 闭 群 携 带 猪 内 源 性 逆 转 录 病 毒 (porcine endogenous retrovirus, PERV)存在与表达的情况，为该猪种作为器官移植供体的生物安 全性提供现实依据，笔者从上海嘉定区梅山猪育种中心的梅山猪封闭群内随机采集 45 头猪的耳组织，并构建耳成纤维细胞系，利用 PCR 检测 PERV 前病毒核心蛋白基因 (gag)、多聚酶基因(pol)以及囊膜基因(env)的基因组 DNA，利用 RT-PCR 的方法检测 mRNA 表达状况。结果发现被检测的 45 份样品均携带完整的 3 种亚型的 PERV 前病 毒 DNA；RT-PCR 结果显示，45 份样品中有 40 份同时有 PERV-A 和 PERV-B 两种亚 型的表达，还有 5 份样品仅检测到 PERV-B 亚型的表达，未检测到 PERV-C 亚型的表 达。鉴于生物安全性方面的考虑，该猪种能否作为人异种移植的供体仍有待进一步商 榷。 关键词：基因组编辑，耳成纤维细胞，猪，趋化因子受体 5，内源性逆转录病毒 PAGE PAGE III Genome engineering in pig CCR5 gene using new editing tools ABSTRACT Animal genome editing technology is a challenging technology which allows human change the genetic composition of animals as possible as they want to. For it is easy and precise to add, delete, and replacement DNA sequences, the technology shows broad application prospects in livestock breeding for improving product