吉非替尼诱导肺癌细胞凋亡及其机制研究-外科学专业论文.docxVIP

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河北医科大学 河北医科大学 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本学位论文在导师(或指导小组)的指导下,由本人独立完成。 本学位论文研究所获的研究成果,其知识产权归河北医科大学所有。 河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学 位论文主要内容相关的论文,第一署名单位为河北医科大学,试验材 料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否贝IJ,一 承担相应的法律责任。 /、、一.? 研究生虢拟2导师铭恻学院领导羔:。≥溶、研究生签名:老从2 导师签名:写岛锄学院领导签名:。矽潴’ 吩.年岁月掰’。。_,, 河北医科大学 研究生学位论文独创性声明 文中特别加以标注和致谢等内容外,文中不包含其他人已经发表或撰 写的研究成果,指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写, 研究』签名姒矽锄签名铡。 文责自负。 斧_月 Et 中文摘要 中文摘要 吉非替尼诱导肺癌细胞凋亡及其相关机制研究 摘 要 目的:通过体外实验研究表皮生长因子受体抑制剂吉非 替尼诱导肺癌细胞A549、H460凋亡的作用,并检测其下游 信号通路,了解靶向药物的抗肿瘤活性,探讨其中存在机制。 方法: 1本实验选用两个肺癌细胞株A549、H460为研究对象,采 用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定两株细胞对吉非替尼 的敏感性。取对数生长期上述细胞接种96孔板,加入相 应浓度吉非替尼,72d时后加入MTT,通过多通道酶标 仪检测各孔的吸光值A(波长=490nm,以波长520nm为参 考)。计算细胞IC50,为下一步选择合适药物浓度诱导上 述细胞凋亡提供参考。 2取209M吉非替尼作用于A549、H460两种肺癌细胞,加药 24d,时后,甲醇固定细胞,DAPI染色后,置倒置荧光显 微镜下观察,观察吉非替尼的诱导肺癌细胞凋亡作用。 3取对数生长期细胞,铺25ram培养瓶,待细胞完全贴壁后 加入不同浓度0、0.1、1.0、8.09M吉非替尼,药物处理 细胞2h后,再加入终浓度30ng/mlEGF,刺激细胞表皮生 长因子受体(EGFR)及相应下游信号的磷酸化,15min 后消化细胞,用含磷酸酶抑制剂的冷PBS洗涤3次。RIPA 试剂盒抽提细胞总蛋白。用Bradford蛋白分析试剂盒测量 所提取蛋白的浓度。应用Western.Blotting方法检测细胞加 药后EGFR及磷酸化EGFR(p.EGFR)、Akt及磷酸化Akt 中文摘要(p.Akt)蛋白水平变化,以GAPDH为内参照。 中文摘要 (p.Akt)蛋白水平变化,以GAPDH为内参照。 结果: l 吉非替尼浓度为3、6、8、lO、12.5、25、50洲时,A549 细胞的增殖抑制率分别是8.26%、40.76%、45.87%、45.72%、 55.69%、86.79%、95.67%;H460细胞的增殖抑制率分别 是0.72%、3.44%、17.4%、12.52%、22.71%、68.91%、 94.05%。该组数据表明靶向EGFR的酪氨酸激酶抑制剂吉 非替尼对A549、H460细胞的增殖均有明显的抑制作用,并 且这种作用为剂量依赖性,随药物浓度的升高抑制率逐渐 升高。吉非替尼抑带1JA549、H460细胞增殖的IC50分别为 10.8l“M,18.44}tM,与相关文献报道的结果相似。 2取20州吉非替尼作用于A549、H460两种肺癌细胞,24 小时后经DAPI染色,在倒置荧光显微镜下观察,光镜下 可见凋亡细胞,细胞核内可见浓染致密的颗粒荧光,典 型凋亡细胞核出现新月型改变,核固缩或片段化。本实 验在体外模拟了吉非替尼的作用,观察了靶向药物吉非 替尼诱导肺癌细胞凋亡的作用。 3 Western.Blotting方法检测EGFR、Akt蛋白磷酸化的结果 显示:EGFR在肺癌A549和H460细胞系均有表达,在A549 细胞系表达相对较高。在吉非替尼浓度为1.01xM时,两 细胞系中EGFR蛋白的磷酸化开始受到抑制,并随着药物 浓度的增加受抑制程度逐渐明显,当吉非替尼浓度为 8.0}tM时,两个细胞系EGFR蛋白的磷酸化几乎完全被抑 制。两细胞系中磷酸化的Akt蛋白在吉非替尼浓度较低时 即能够受到一定程度的抑制,并随着浓度的增加受抑制 程度逐渐明显。 中文摘要结论: 中文摘要 结论: 本研究选取肺癌细胞株A549、H460为研究对象,采用 MMT法观察两个细胞株对吉非替尼的药物敏感性,结果表明: 吉非替尼对A549、H460细胞的增殖均有明显的抑制作用, 并且这种作用呈剂量依赖性。吉非替尼抑朱i]A549、H460细 胞增殖的IC50分别为10.81州,18.44州。取接近IC50值20州 吉非替尼诱导A549、H460细胞凋亡,经DAPI染色后观察到 细胞核内可见浓染致密的颗粒荧光,典型凋亡细胞核

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