课件：载脂蛋白.pptVIP

用于PCR的引物序列为 　　IN/DE-5’ CAGCTGGCGATGGACCCGCCGA 　　IN/DE-3’ ACCGGCCCTGGCGCCCGCCAGCA Wu等报告del/del基因型在高胆固醇血症患者中比对照组中多见。Renges等对伦敦地区亚洲后裔的研究也发现带del基因型者血浆总胆固醇升高，但与冠心病无明显关系。Peacock等提出Ins/del多态性与冠心病的发展，即其严重程度有关，也有报道Ins/del多态性在冠心病与对照组中无明显差别 THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 四、ApoE基因型的检测 　 采用PCR、RFLP技术从基因水平检测ApoE基因多态性（基因型），操作简便、快速准确 1．仪器与试剂 （1）仪器：电泳仪、基因扩增仪； 　(2）试剂：Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA参考物（pBR322DNA/HacⅢmarkers）、HhaⅠ 2．实验方法 （1）引物的设计与合成 常用序列为 P1：5’-AACAACTGACCCCGGTGGCG-3’；P2：5’-ATGGCGCTGAGGCCGCGCTC-3’。特异性扩增ApoE基因第4外显子区含编码112位与158位氨基酸的基因序列（如图-5）。产物片段292bp。 图5 PCR扩增产物经HhaⅠ酶切后RFLP模式 （2）模板DNA提取 ①经典法，取全血100μl，蛋白酶K消化，按标准酚、氯仿、异戊醇法提取DNA； ②碘化钠法，参照Loparev等法加以改良，取全血1加NaⅠ，加氯仿/异戊醇（24：1），离心后取上清加异丙醇提取DNA ③微量血斑水煮法，取50μl全血点至无菌滤纸上，自然干燥后用甲醇固定，室温贮存。临用时，剪成一直径5mm的圆形血斑纸块，将其混至100μl无菌双蒸水中，100℃煮沸30min以裂解细胞。取混合物15μl作膜板用。 （3）PCR扩增； 反应体系为50μl 按下列程序循环35 94℃变性1min，65℃退火1min，72℃延伸1.5min,最后于72℃再延伸10min， 取产物10μl经2%琼脂糖凝胶电泳（溴化乙啶），紫外灯下观察扩增为292bp。 （4）扩增产物的限制性酶切 PCR扩增产物17μl直接用10UHhaⅠ酶切，37℃消化4h。反应终止后产物经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，EB染色35min，以DNA片段长度标准物为参考，紫外灯下观察结果并照像 ApoE基因型判定参照Richard等方法 ε2/2出现3条带（91bp,83bp,61bp） ε3/2出现5条带（91bp,83bp,61bp48bp,35bp） ε3/3出现4条带（91bp,61bp48bp,35bp） ε4/3出现5条带（91bp,83bp,61bp48bp,35bp）（91bp,72bp,61bp,48bp,35bp） ε4/2出现6条带（91bp,83bp,72bp,61bp，48bp,35bp） ε4/4出现4条带（72bp,61bp,48bp,35bp） 该法检测的ApoE基因型图谱如表2所示 　*：P＜0.05；**P＜0.01(均与对照组比较) 　　表中所示动脉粥样硬化性脑梗死（ABI） 病人ε4/3基因型频率（30.0%）与ε4等位基因频率(18.0%)均显著高于健康对照组 表2 人ApoE基因型和等位基因频率分布（%） 组别 例数 ApoE基因型频率 ApoE等位基因频率 E2/2 E3/2 E4/2 E3/3 E4/3 E4/4 E2 E3 E4 对照组 113 0 16.8 1.8 69.0 11.5 0.9 9.3 83.2 7.5 ABI 50 0 16.0 2.0 50.0 30.0** 9.0 73.0* 18.0** 　五、ApoE表型检测的临床意义 1．人群ApoE表型 人群中存在六种ApoE表型，其由位于一个基因位点的三个共显性等位基因所控制。正常人群中以E3/3表型频率最高（超过50%）；含E3的杂合子（E4/3、E3/2）居中（二者之和超过20%）；E2/2、E4/4和E4/2表型频率最低（三者之和不超过8% 2．ApoE表型分布ApoE表型与等位基因频率分布具有一定种族差异性 无性别差异。中国人与日本人群十分相似，E3频率均高于80%，而欧美人群均低于80%。欧洲人E4等位基因频率从北到南呈下降梯度分布，亚洲人E4频率低（4.9%～12.7%），相比之下，非洲黑人及巴布亚新几内亚人E4频率高（约分别为30%、36.8%） 　3．ApoE表型与高脂血症?ApoE多态性可能与不同的高脂血症（HLP）、CHD发生的种族差异及家族倾向有关 已发现Ⅲ型HLP患者几乎无例外的均为E2/2表型，易早发严重的AS。V型HLP患者