基质金属蛋白酶活性中心肽段的合成、纯化及与金属离子作用分析-分析化学专业论文.docx

聊城大学硕士学位论文 聊城大学硕士学位论文 ii ii 活性中心肽段，即 Ala-His-Glu-Phe-Gly-His-Val-Leu-Gly-Leu-Gln-His-Thr（简称 P13 肽）和 Ala-Ala-His-Glu-Leu-Gly-His-Ser-Leu-Gly-Leu-Ser-His-Ser-Thr（简称 P15 肽）。 P13 肽和 P15 肽的分析和纯化在 HPLC 上进行。粗肽溶解于纯水中，在分析型色谱柱 上进行分析（250×4.6mm，5μm，流速 1ml/min；流动相 A，0.1% TFA； 流动相 B， 90% CH3CN+0.1% TFA；UV 检测波长 214nm；梯度条件：10%-70%B 55 min）。根据 分析色谱结果，优化条件后在半制备色谱柱上进行纯化（250×10mm，流速 4.7ml/min， 流动相 A，0.1% TFA； 流动相 B，90% CH3CN+0.1% TFA）。最终纯化出了高纯度的 P13 肽和 P15 肽（98.7% P13 肽，99.0% P15 肽）。 用电喷雾质谱分别测定了 P13 肽和 P15 肽的分子量，与理论分子量吻合。1H NMR 数据证实了 P13 肽和 P15 肽中特征性官能团的存在。因此验证了 P13 肽和 P15 肽合 成和纯化的正确性。这为下一步研究 P13 肽和 P15 肽的性质奠定了基础。 二、核磁共振光谱研究 P13 肽和 P15 肽与金属离子的作用。利用一维核磁共振 光谱分别对 P13 肽和 P15 肽与 Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+ 等金属离子的相互作用进行了 研究。实验结果表明，P13 肽和 P15 肽均能与这些金属离子发生配位作用，其作用位 点为该活性中心肽段的三个高度保守的 His 的咪唑环。而且，不同的金属离子对活性 中心肽段的结构影响也不尽相同。从核磁谱图可以看出，P13 肽和 P15 肽分别与 Cu2+ 和 Co2+ 作用时，His 区域的信号峰明显消失，尤其是与 Cu2+ 作用时更为明显，Cu2+ 与 His 咪唑环的 N 配位后使 His 咪唑环上 N 相邻的 H 信号明显降低或完全消失。而 P13 肽和 P15 肽与 Zn2+ 作用时，His 区域的 H 信号仅有较小程度的降低，尤其在高 场区变化更小。这说明 P13 肽和 P15 肽与 Cu2+、Co2+配位能力强于 Zn2+，并且与 Cu2+ 和 Co2+作用后对其结构的影响也强于 Zn2+。 三、紫外可见吸收光谱研究 P13 肽和 P15 肽与金属离子的作用。利用紫外可见 吸收光谱法分别对 P13 肽和 P15 肽与 Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+ 等金属离子的相互作用 进行了研究。实验结果表明，P13 肽和 P15 肽与金属离子作用后，其 225 nm 附近的 吸收峰均出现明显增大，这可能是由于肽与金属配位对其酰胺键产生的影响造成的。 随着金属离子浓度的增加，225 nm 处的吸光度逐渐增大，但当金属离子与肽浓度达 到 1:1 时，225 nm 处的吸光度不再变化，这说明 P13 肽和 P15 肽与金属离子均为 1:1 配位结合。当 P15 肽与 Cu2+ 和 Co2+ 作用时，随着 Cu2+ 浓度的增大，在可见光区出 现了新的吸收峰，这是由于 Cu2+ 和 Co2+ d-d 电子跃迁产生的。从 P13 肽和 P15 肽与 iii iii Zn2+ 作用的紫外光谱中可以看出，Zn2+ 与肽配位后 225 nm 处的吸光度变化不大。这 也说明了 Zn2+ 与肽配位对肽本身的结构影响较小，这与核磁共振光谱的实验结果是 一致的。 四、圆二色光谱研究 P13 肽和 P15 肽与金属离子的作用。圆二色光谱能快速测 定蛋白质和多肽的二级结构，在研究蛋白质和多肽的性质中发挥着重要的作用。酰胺 键是用 CD 谱观察肽和蛋白最重要的发色团，已经确定它有两种迁移方式 n-π*迁移通 常很弱，在 220nm 处呈一负带。它的能量（波长）对氢键的形成敏感。π-π*迁移一 般较强，在 192 nm 附近出现一正带，在 210 nm 处出现一个负带。本文利用圆二色光 谱分别对 P13 肽和 P15 肽与 Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+ 等金属离子的相互作用进行了研 究。结果表明，无论是 P13 肽还是 P15 肽与金属离子配位后，均对其二级结构产生 了一定的影响。P13 肽和 P15 肽与不同的金属离子作用时对其二级结构的影响也不相 同，无论是 P13 肽还是 P15 肽与 Cu2+ 作用后对其结构的影响都非常明显，而与 Zn2+ 作用时其构象变化比较小，这也与核磁共振光谱和紫外可见吸收光谱的实验结果是一 致的。 关键词：基质金属蛋白酶；活性中心，