基因工程的基本操作程序指南.pptVIP

1.2 基因工程的基本操作程序 基因工程的基本操作程序 （1）目的基因的获取 （2）基因表达载体的构建 （3）将目的基因导入受体细胞 （4）目的基因的检测与鉴定 一、目的基因的获取 1、目的基因：主要指的是编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。 2、获取方法： （1）从基因文库中获取目的基因； （2）利用PCR技术扩增目的基因； （3）通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成 （一）从基因文库中获取目的基因 1.什么叫基因文库？ 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。 终止子是位于基因尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录。 （二）方法 将目的基因导入 植物细胞 将目的基因导入 动物细胞 将目的基因导入 微生物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 ——显微注射法 ——感受态细胞 1、将目的基因导入植物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 （1）农杆菌转化法 ②原理： Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。 ①特点： 易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力 ③转化过程: Ti质粒 目的基因 构建 表达载体 导入 植物细胞 插入 植物细胞染色DNA 表达 新性状 转入 农杆菌 基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。 （2）基因枪法 适用于单子叶植物 （3）花粉通道法 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。 适用于被子植物 2、将目的基因导入动物细胞 （1）方法：显微注射法（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中） （2）操作程序: 提纯含目的基因表达载体 取受精卵 显微注射 移植到子宫 受精卵发育 新性状动物 常用法：Ca2+处理 常用菌：大肠杆菌 微生物作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少 过程： Ca2+处理大肠杆菌 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA 3、将目的基因导入微生物细胞 导入方法 受体细胞 微生物 动物 植物 受体生物 受精卵 体细胞 受精卵 细胞/个体 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 显微注 射技术 用Ca2+处理成感受态细胞 四、目的基因的检测与鉴定 分子水平鉴定 个体生物学水平鉴定 是否插入目的基因 是否转录 是否翻译 1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 ① 首先取出转基因生物的基因组DNA； （1）方法: DNA分子杂交 （2）过程: ② 将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针； ③ 使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中。 （一）分子水平检测 基因探针：是一段带有检测标记，且序列已知的，与目的基因互补的核酸序列。 　 基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。 单链DNA DNA分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。 凝胶电泳 放射自显影照片 * 基因文库 基因组文库 部分基因文库 （cDNA文库） 基因组DNA 切割 与载体连接 导入宿主细胞 宿主DNA A B C D E F A B C D E F A B C D E F 基因组文库的构建过程 原核细胞的基因结构 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 启动子 终止子 编码区 非编码区 非编码区 内含子 外显子 启动子 终止子 编码区上游 编码区下游 真核细胞的基因结构 拓展 结构基因 外显子 内含子 转录、加工修饰 mRNA 拓展 反转录合成cDNA， 再合成双链cDNA。 cDNA片段与载体结合 重组载体导入宿主菌 挑取阳性克隆，获取目的基因 cDNA文库的构建过程 基因组DNA文库 cDNA文库 基因组文库和cDNA文库的比较 物种间基因交流 基因多少 基因中内含子 基因中启动子 文库大小 基因组文库 cDNA文库 文库类型 小 大 无 有 无 有 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因 可以 部分基因可以 （二）利用PCR