急性分离大鼠下丘脑神经元自发性放电触发机制研究-细胞生物学专业论文.docxVIP

博士学位论文急性分离大鼠下丘脑神经元 博士学位论文 急性分离大鼠下丘脑神经元 自发性放电触发机制研究 博士研究生：吴航宇 指导教师：邹飞教授 摘要 研究背景 细胞温度敏感机制是目前环境生命科学研究的热点之一。近年来围绕温度敏 感的分子感受和调控机制，研究者从多个方面进行了探索，包括钾通道、瞬时受 体电位通道、氨基酸类受体(包括谷氨酸受体和Y．氨基丁酸受体)、内生阿片样 受体、ATP受体蛋白等都有参与，这些分子主要参与对细胞放电幅度和频率、对 周围系统的产热和散热系统进行调节。但总的来说，目前对于这些调控分子的研 究还处于起步阶段，可能还存在一些关键的调控分子尚未得到重视或发现。下丘 脑，特别是视前区／前部下丘脑(Preoptic and anteriorhypothalamus，PO／AH)中的 神经元参与了多种机体活动，例如温度调控、饮食行为等等，在众多的功能之中， 其作为机体感受温度变化并调控相应反应的中枢器官尤其为人们所重视及认同。 早在一个世纪以前，人们通过毁损或刺激下丘脑的方法，就己确认下丘脑是 机体温度调控的重要神经结构单位，它能够粗略地感受周围组织温度变化及触发 某些温度调节反应，并在上位结构的调控下，以更加精确的方式控制机体对温度 变化的反应。随着研究的深入以及方法学上的改进，人们更是将下丘脑对温度的 调控位置锁定于P0／AH区域，并发现P0／AH不仅能够感受中枢神经系统的温度 变化且通过内侧前脑束作用于效应器产生调控作用，还可接受遍布躯体的温度感 受器的传入信息，将外周温度信息与中枢的信息进行比较和整合，从而更加有效 及精确地调整机体对温度变化的反应。虽然人们对下丘脑神经元的热敏感性已有 了越来越清晰全面的认识，但却一直无法确定这种热敏感性的机制，各种结果莫 衷一是，有的认为是短暂的离子流触发了温度感受，也有人认为持续的离子流才 是温度敏感机制的基础。在这些研究中，有研究者认为一种短暂的外向钾离子电 摘要流(A电流，IA)由于具有较高的温度敏感性，并且A电流对触发细胞放电的前 摘要 流(A电流，IA)由于具有较高的温度敏感性，并且A电流对触发细胞放电的前 电位有重要作用，因而A电流有可能参与PO／AH温度敏感过程； 还有的人则 相信TRP超家族中的TRPV通道家族由于具有很高的温度敏感性而在PO／AH发 挥重要作用，其开放可导致内向的Na+和Ca+混合离子流，从而增加膜电导，促 使神经元放电频率上升。事实上，可改变神经元动作电位时程的因素均有参与神 经元的温度敏感机制形成的可能性，例如超极化激活环核苷酸门控离子通道 (hyperpolarization—activated，cyclic nucleotide-gated channels，HCN channel)可由 细胞膜电位的超极化而激活，造成胞外Na+及K+内流，从而使膜电位有去极化 的趋势，进而影响细胞AP。加上下丘脑中表达有HCN通道的事实，使得对下 丘脑温度敏感机制的研究又增添了新的线索。 下丘脑对于机体温度感受及调节的重要性早已获得公认，然而由于下丘脑组 织含有种类繁多、性质各异的神经元，加上各种神经元之间相互的作用，使得在 整体动物及脑片上进行的实验研究涉及到太多的影响因素及作用机制：而另一方 面，亦有研究人员对培养状态下的下丘脑PO／AH神经元电生理特性及温度敏感 性进行了研究，但是培养状态下的细胞面对着与体内截然不同的内环境，其细胞 性状及特性还有基因表达等等均会产生或多或少的改变，因此从培养神经元获得 的实验资料并不能准确地反映其在体内真实性状。因此有必要对急性分离的下丘 脑神经元电生理特性进行研究，以使人们对下丘脑的认识更加全面。 HCN通道功能的纷繁复杂，不同种类细胞中HCN通道的特性也各不相同， 变化多端，相当多的研究已揭示下丘脑组织区域表达有丰富的HCN通道，然而 对下丘脑神经元的电生理特性中HCN通道的功能却少有研究涉及。 目的 1．探讨急性分离的大鼠下丘脑神经元自发放电特性以及其温度敏感性。 2．研究HCN通道各亚型mRNA在相应单个自发放电神经元中的表达情况。 3．探索下丘脑神经元的温度敏感内在机制以及其与HCN通道之间的联系， 从而为下丘脑温度感应及调控机制研究找到新的线索。 方法 II 博士学位论文1． 博士学位论文 1． 利用酶消化下丘脑脑片及机械分离方法获得急性分离的神经元，为 后继实验提供状态良好的神经元。 2． 采用全细胞模式膜片钳记录大鼠下丘脑神经元的自发放电活动及Ih 电流，明确其电生理特性并施加温度影响。 3． 采用单细胞RT．PCR技术检测前述电生理实验确定的各类型神经元 中HCN通道mRNA的表达情况，并利用限制性内切酶酶切反应来验证PCR产 物的特异性 结果 1．利用酶消化下丘脑脑片及机械分离方法可成