彗星试验检测冷冻大鼠肝脏和肌肉细胞辐照后DNA损伤研究-公共卫生专业论文.docxVIP

浙江大学MPH研究生学位论文目前，国内外已有一些应用于辐照食品的检测的方法研究，如用气相色谱法 浙江大学MPH研究生学位论文 目前，国内外已有一些应用于辐照食品的检测的方法研究，如用气相色谱法 分析含脂肪辐照食品中形成新的碳氢化合物；用气相色谱一质谱联用法分析含脂 肪的辐照食品中形成的2一十二烷基环丁酮；用电子自旋共振技术检测法(ESR) 检测含纤维素、骨头和结晶糖的食品经辐照所产生的自由基；用光刺激发光法 (PSL)检测含矿物质残留的食品经辐照前与辐照后激发光谱的差异；用热发光 法(TL)分析含有硅酸盐粒子的辐照食品在控制加热条件下释放能量所得的孔 辉光曲线。这些方法都需要相对较为复杂的仪器和昂贵设备，并且样品制备和分 析过程需要较长时间。不能满足大批量样品检测的需要，因此对于新的辐照食品 检测技术应用研究的要求依然十分迫切。 在肉类食品经X射线、Y射线或电子高速射线辐照处理消毒灭菌过程中，肉 类组织细胞内DNA也可能会受到损伤，产生大量的单链和双链的DNA片段。 这种由辐照导致DNA损伤产生的裂解物可作为辐照处理的标记物，使用一种相 对简单的方法进行检测可以对辐照食品进行筛选。彗星试验技术是一种相对灵 敏、简便的DNA损伤的检测技术。该技术原理是在细胞裂解液的作用下，细胞 膜、核膜被破坏，RNA，蛋白质等从细胞中逸出，扩散到裂解液中，只有核DNA仍 停留在原位。如果细胞未受到损伤，经荧光染色后细胞核呈圆形。如果细胞受损， 在碱性条件下，DNA双链解旋成单链，片断进入凝胶。电泳时，片断由于分子量 较小、本身带负电荷，在电泳场的作用下离开主核向阳极移动。经荧光染料染色 后，其形状犹如彗星。细胞核DNA受损伤愈严重，产生的断裂愈多，其片断也就 愈小，在电场作用下迁移的DNA量多，迁移的距离长．放射生物学研究表明，该 技术可用于检测精子细胞、肿瘤细胞和淋巴细胞等哺乳动物细胞受辐照后的DNA 损伤。近年来，随着科学技术的不断进步，各种有关软件的深层开发，使得这一 技术增添了许多新的内涵。本研究用大鼠肝细胞和大鼠肌肉细胞为靶组织，经辐 照和冷冻后，再用彗星试验来检测肝细胞和肌肉细胞的DNA损伤，从而探讨经过 辐照的冰冻组织是否能用彗星试验检测出DNA损伤。为验证彗星试验应用于肉类 食品是否经过辐照处理，提供实验研究的基础。 2、材料与方法 2．1样品 2 浙江大学MPH研究生学位论文SD大鼠六只，雌雄各半，体重约200克，出浙江省医学科学院实验动物中心提 浙江大学MPH研究生学位论文 SD大鼠六只，雌雄各半，体重约200克，出浙江省医学科学院实验动物中心提 供。处死后取肝脏和肌肉组织各五份，经直线加速器辐射后冰冻保存，辐射剂量 分别为OGy、0．5Gy、1．OGy、2．OGy和4．OGy。肝脏和肌肉组织冰冻保存3天后 分离肝细胞和肌肉细胞。 2．2方法 取出冰冻的肝脏与肌肉组织进行细胞分离，收集细胞悬液，调整细胞密度并用台 盼蓝染色计数细胞存活率，经制片、细胞裂解、电泳、中和、染色等步骤后在激 光共聚焦显微镜下观察。测量彗星图像指标是彗星尾长与尾相。 3、结果 3．1大鼠肝细胞不同剂量辐照DNA损伤的检测结果 3．1．1通过对不同辐照剂量组之间彗星电泳检测的平均尾长(MTL)比较分析， 发现经剂量为L OGy、2．OGy、4．OGy辐照的肝细胞与未经辐照的肝细胞DNA损伤 存在明显差异(pO．05或pO．01)。并且用尾长所测的肝细胞DNA损伤随辐照剂 量的增加而增长，DNA损伤与辐照剂量之间存在明显的剂量一反应关系 (r=0．8l,pO．01)。 ：；．I．2迎过对／1i同剂量组之间彗星电泳检测的平均尾相(MTM)比较分析，发现 经剂量为4．OGy辐照的肝细胞与未经辐照的肝细胞DNA损伤存在明显差异 (pO．01)。并且用尾相所测的肝细胞DNA损伤随辐照剂量的增加而增长，DNA 损伤与辐照剂量之间存在明显的剂量一反应关系(酬．69．pO．01)。 3．2大鼠肌肉细胞不同剂量辐照DNA损伤的检测结果 3，2．1通过对不同辐照剂量组之间彗星电泳检测的平均尾长(MTL)比较分析， 发现经剂量为2．OGy和4．OGy辐照的肌肉细胞与未经辐照的肌肉细胞DNA损伤存 在明显差异(pO．01)。并且用尾长所测的肌肉细胞DNA损伤随辐照剂量的增加 而增长，DNA损伤与辐照剂量之问存在明显的剂量一反应关系(r=0．87，pO．01)。 浙江大学MPH研究生学位论文3．2．2通过对不同剂量组之『日J彗星电泳检测的平均尾相(MTM)比较分析，发现 浙江大学MPH研究生学位论文 3．2．2通过对不同剂量组之『日J彗星电泳检测的平均尾相(MTM)比较分析，发现 经剂量为1．OGy、2．OGy和4．OGy辐照的肌肉细胞与未经辐照的肌肉细胞DNA损 伤存在明