活细胞可视化研究NMDA受体在神经元的表面表达、分布及其与突触形成和功能的关系-药理学专业论文.docx

中国协和医科人学I尊。J：学位论文活细胞可视化研究NMDA受体在神经元的 中国协和医科人学I尊。J：学位论文 活细胞可视化研究NMDA受体在神经元的 表面表达、分布及其与突触形成和功能的关系 中文摘要 突触形成和可塑性是神经环路建立和神经系统可塑性的基础。突触 形成主要决定于遗传和发育过程的调控，而突触可塑性则主要依赖于突 触的活动和经验(学习和记忆)，二者均涉及一系列复杂的分子和细胞 机理，并伴有显著的形态学改变。 兴奋性突触突触后亲离子型谷氨酸受体主要是AMPA (oL—amino一3一hydroxy一5一methyl一4-isoxaz01epropionate， AMPA)受 体和NMDA(N-methyl—D—aspartate，NMDA)受体，二者协同完成兴奋 性突触的传递和介导复杂的生理功能。已知NMDA受体与许多复杂的生 理和病理机制有关，如突触的可塑性、长时程增强作用(LTP)、学习和 记忆、兴奋性神经毒性、神经退行性变性疾病等。 已克隆到3个编码NMDA受体亚单位蛋白的基因家族，即NRl一NR3。 其中NRl为一个独立的基因，但可产生8个剪接变体：NR2共有4个相 关的基因，NR2A、NR2B、NR2C和NR2D；NR3则有2个基因，分别为NR3A 和NR3B。重组受体的研究表明：NRl亚单位是NⅦvlI)A受体复合物的必需 组分，而不同的NR2亚单位则可与NRl形成具有不同通道特征的NMDA 受体复合物。NRI不同的剪接变体也赋予NMDA受体通道不同的功能特 中固协和医科人学博I学位论文征。 中固协和医科人学博I学位论文 征。 在中枢神经系统的发育过程中。 NRl亚单位广泛表达于中枢神经 系统，而NR2A一2D亚单位的表达则呈脑区和发育过程的依赖性。在海马 和皮质中NR2A和NR2B的表达占主导地位，但由于NR2A和NR2B在不同 的发育阶段相对表达量的不同，因此它们对NMDA受体通道组成的相对 贡献也在改变，结果受体的功能也各异。研究提示，大脑成熟过程中海 马兴奋性突触可塑性程度的下降可能机制是NMDA受体功能的改变。因 此，理解在发育过程中NMDA受体结构和功能的多样性与其在突触后膜 突触位点的亚单位组成和空间分布之间的关系至关重要。 另外，由于神经元结构的复杂性和个体突触受体组成的分子异质 性，用传统生物化学、电生理学和药理学等方法获得的集团平均 (assembly average)数据来解释神经元的功能受到很大限制，因而， 在方法学上引入活细胞实时单分子可视化研究成为近年来在分子和细 胞神经生物学研究中的一个显著的进展。如可采用转染荧光蛋白标记受 体亚单位神经元的荧光显微成象术、荧光漂白和荧光共振能量转移等来 研究受体蛋白在活细胞的动力学特性。其中，源于水母发光蛋白的绿荧 光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的应用较为广泛。已有采 用GFP标记 氨基乙酸(GABA．)受体和AMPA受体的研究报告。最近， 有关GFP标记NMDA受体NRl亚单位的研究报告指出，当它与NR2A亚单 位共转染HEK293细胞时能形成具有功能的NMDA受体，转染培养海马神 经元时能在树突上形成荧光受体簇。 在本研究中，我们分别构建了GFP标记NMDA受体NRl、NR2A和NR2B 中国协和医科人学博|：学位论史亚单位的真核表达载体，经转染HEK293细胞证实这些GFP标记的受体 中国协和医科人学博|：学位论史 亚单位的真核表达载体，经转染HEK293细胞证实这些GFP标记的受体 亚单位具有良好的荧光信号，同时具有与相应野生型亚单位相同的通道 功能特征。以这些载体为工具，结合活细胞表面受体免疫染色技术，我 们作了如下研究：(1)为研究NMDA受体在HEK细胞表面表达及其可能 相关的调节机制，先用不同的GFP标记NMDA受体亚单位转染或共转染 HEK293细胞．然后采用抗GFP抗体和Cy3交联的二抗对转染细胞作活 细胞表面染色，分析了NRl亚单位不同的剪接变体、NRl和NR2的装配、 以及PKC激活对NMDA受体在HEK293细胞表面表达的影响。结果发现缺 乏Cl和C2外显子盒的NRl剪接变体pGFP—NRl—4a单独转染HEK293细 胞可获表面表达：不同NR2亚单位与NRl一la组合的共转染均可检出表 面表达的NMDA受体：另外，用PKC激活剂PMA处理细胞后能使单独转 染的pGFP—NR2A获得表面表达。这些结果提示NMDA受体的表面表达涉 及多种调节机制，包括NRl亚单位剪接变体的分子结构、异聚体的装配 以及PKC的磷酸化等。(2)观察GFP标记NMDA受体亚单位在培养海马 神经元的表达和表面受体的免疫荧光染色。在发育早期海马神经元中， GFP—NRl—1a、GFP—NR2A和GFP—NR