细菌内毒素检测.ppt

2006年6月 山东省药品检验所 《中国药典》细菌内毒素检验及方法建立  细菌内毒素概述  前言 细菌内毒素 一、前言 热源检查易受试验动物个体差异、方法灵敏度、药物本身性质的影响，受到一定限制，与家兔热原法相比，细菌内毒素检查法具有劳动强度低，实验成本小等特点，还可以通过对原料、活性成分、灭菌水、容器、赋形剂和终产品的细菌内毒素检测，对生产过程进行质控，更明显的特点是可以定量检测药品生产过程中可能污染的痕量内毒素，为区分干扰作用与内毒素污染提供了极为重要的技术手段。 二.细菌内毒素的概念 细菌内毒素是革兰阴性菌细胞壁个层上的特有结构，内毒素为外源致热源，它可激活中性粒细胞，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢，引起发热。 内毒素的主要成分为脂多糖中(LPS)的类脂A 过去一直认为细菌内毒素来源于革兰阴性细菌，但最近发现存在革兰阴性菌来源的不具有内毒素毒性的革兰阴性细菌脂多糖（LPS）结构。因此，目前认为所有内毒素均为脂多糖，但非所有的脂多糖均为内毒素。 2 鲎试剂反应机制 参与鲎血细胞凝集的成分是细菌内毒素的C因子、B因子、G因子、凝固酶原和凝固蛋白原。 G因子激活的鲎试剂激活旁路，鲎试剂中的G因子可以被真菌、酵母和藻类细胞壁中另一类细菌多糖--（1，3）-β-D-葡聚糖激活，因此鲎试剂同内毒素的反应不是特异的。LPS不能激活G因子旁路。 但是，鲎试剂同葡聚糖的反应与鲎试剂同内毒素的反应敏感性是不一致的。有实验表明不同的鲎试剂在检测葡聚糖和内毒素上存在很大的差异，鲎试剂与内毒素的反应更灵敏。 尽管与鲎试剂反应的物质不完全是内毒素， 但目前作为鲎实验基础的两个原则仍是：1、内毒素活性与热原性相关，家兔和鲎实验作为人类发热和炎症反应的预测方法是相关的。2、在注射剂GMP生产环境下，不存在内毒素也就意味着不存在主要的热原物质。 3 鲎试剂凝胶反应的特征 ⑴随着鲎试剂反应的进行，凝固蛋白不断增加，伴随凝聚的形成，光密度也会增加。 ⑵内毒素的浓度决定了光密度增加的速率。 ⑶凝胶形成反应呈S型曲线（分为初期的平台期、快速增长期和后期的平台期）。 这些特性构成了各种检测方法的理论基础。 4 细菌内毒素标准品 1.0IU=1.0EU 细菌内毒素标准品分为细菌内毒素国家标准品和细菌内毒素工作标准品。 细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成。用于标定、符合、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价 细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照 细菌内毒素检查方法的建立 方法 标准物质 限值的确定 干扰试验 检验 一、方法 细菌内毒素检查法包括凝胶法和光度测定法 凝胶法为限量测定方法，光度测定法为定量测定方法 凝胶法分为限量试验和半定量试验；光度测定法包括浊度法（动态浊度法、终点浊度法）、显色法（动态显色法和终点显色法） 两种方法可任选一种进行内毒素的检测 当测定结果有争议时，除有特殊规定外，以凝胶法结果为准 二、标准物质 除另有规定外，细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作对照品应使用由中国药品生物制品检定所统一发放的标准品 三、限值的确定 1 计算公式 L=K/M ······· 药品人用最大剂量参考《国家药品标准化学药品说明书内容汇编》。 L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示； K为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/(kg·h)表示，注射剂K=5E U/(kg·h)，放射性药品注射剂K=2.5 EU/(kg·h)，鞘内用注射剂K=0.2 EU/(kg·h)； M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/(kg·h)、mg/ (kg·h)或U/ (kg·h)表示，人均体重按60kg计算，注射时间若不足1小时，按1小时计算。 四、干扰试验 建立新品种细菌内毒素检查法时，要求至少检测三批样品（如为新药需检测连续生产的三批样品），同时使用两个鲎试剂厂家的鲎试剂进行干扰试验。如同一样品对两个厂家的鲎试剂测定结果差异较大，应使用第三个厂家的鲎试剂。在确认该品种在某一浓度下不干扰细菌内毒素检查，或该品种在有效浓度仍有干扰作用但采用适当方法能消除这种干扰时，该品种方可采用细菌内毒素检查方法。 对于只能使用高灵敏度才能消除干扰进行检测的品种，需慎重考虑，最好有另一实验室进行复核。 药品生产厂家建立新品种细菌内毒素检查法时，应将方法学验证试验报告送国家或省级药检所复核。 五、检验 当对供试品阳性检验结果有疑义时，应考虑供试品中是否有可以引起假阳性结果的干扰因素，如葡聚糖等物质。 可采用特