分子生物学实验技能.ppt

Result of TSARG4 gene in adult by multiple-tissue RT-PCR A: TSARG4 gene; B: house keeping gene G3PDH 1: testis; 2 : ovary; 3 : liver; 4 : lung; 5 : kidney; 6 : muscle; 7 : brain 二步法RT-PCR 两步法：1）cDNA第一链的合成： 在0.5 mL EP管中加入无核酸酶的水10 μL，Oligo dT引物1μL，RNA模版1 μL, 混匀，70 ℃水浴，5 min。取出后迅速放入冰中，冷却5min。离心5 s取出，在冰上加入10×PCR 反应缓冲液4 μL ，RNA 抑制酶1 μL, dNTP 2 μL，混匀，37℃水浴孵育，5min。取出后迅速加入逆转录酶1 μL，混匀，置9600型PCR仪中，42℃，1 h，70℃，10 min，完成后，置4 ℃保温。 2）PCR扩增 以cDNA模板进行PCR 扩增 可以以cDNA模板，目的基因和内参基因竞争性PCR扩增来进行半定量检测。 二步法RT-PCR 灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNA酶，可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA。实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有RNA酶污染，使用前必须于180 ℃干烤８小时或更长时间（玻璃器皿）或用氯仿冲洗（塑料制品）。 另一种方法是用0.1 ％焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡用于制备RNA的烧杯，试管和其他用品。DEPC是RNA酶的强烈抑制剂，但其作用并不是绝对的（Fedorcsak和Ehrenberg,1966）。灌满DEPC的玻璃或塑料器皿在37℃放置２小时，然后用灭菌水淋洗数次， 并于100℃干烤15分钟（Kumar和Lindberg,1972）。在15 lbf/in2 (1.034x105Pa)高压蒸气灭菌15分钟。上述处理可以除去器皿上痕量的DEPC，以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。 RNA实验前玻璃制品、塑料制品的处理 用于RNA电泳的电泳槽应用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满3％的 H2O2 溶液，于室温放置10分钟，然后用0.1 ％ DEPC 处理过的水彻底冲洗电泳槽。最好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和电泳槽作上特殊标记，存放在指定地点，为 RNA 实验专用。 电泳槽的处理 溶液 的处理 用高压灭菌的水和RNA研究专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，将溶液装入无RNA酶的玻璃器皿。可能的话溶液均应用0.1％DEPC于37℃至少处理12小时，然后于100℃加热15分钟或在15lbf/in2(1.034x105Pa)的高压下蒸气灭菌15分钟。注：DEPC可与胺类迅速发生化学反应，因些不能用来处理含有Tris 一类的缓冲液。可存几瓶新的未开封的Tris晶体以制备无RNA酶的溶液。 RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此，在准备分离的和分析RNA的材料和溶液时，主有涉及RNA的一切操作过程中，都应戴一次性手套，接触“胖的”玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能沾染上RNA酶，因此进行RNA实验时应勤换手套。 尽量不要对着RNA样品呼气或说话，以防RNA酶污染。 研究人员造成的污染 RNA分离-----Gentra 试剂盒抽提法 1. 取5~10 mg组织放入研钵中，加入适量液氮，研磨。注意研磨过程中不断的加入液氮； 2. 将上述组织全部移入1.5 mL EP 管中，加入300 μL细胞裂解液，用 tip 打匀，置冰上； 3. 加入100 μL Protein-DNA 沉淀液，轻轻上下倒置10次，插入冰中3~5 min； 4. 13 000 r/min 离心3 min； 5. 将上清液移取到另一干净的1.5 mL EP 管中，13 000 r/min 离心3 min； 6. 将上清液移取到另一干净的1.5 mL EP 管中，加入300 μL异丙醇，轻轻上下颠 倒50次，混匀样品，可见RNA白色絮状沉淀； 7. 13 000 r/min 离心1 min，弃上清，将EP管倒置在吸水纸上5 s，吸干余液； 8. 加入300 μL 70 % 的乙醇，轻轻上下颠倒20次，充分洗涤RNA沉淀； 9. 13 000 r/min 离心1min，弃上清，将EP管倒置在吸水纸上，空气干燥5~10 min，加入50 μL RNA水合液冰上溶解RNA 30 min, -70 ℃保存。 Gentra 试剂盒抽提法 2.RNA的质量控制 检测RNA溶液的吸光度280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度