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分子克隆工具酶 ——限制和修饰(restriction and modifying ) 周口师范学院生命科学系 进行基因工程操作，首先要获得需要重组和能够重组的DNA片段。（如何获得？） 用相应的酶进行切割，就可以获得含有完整基因片段、复制起始位点、转录启动子或转录区等具有特定功能的DNA片段。 那么，如何将需要的DNA片段切割和连接呢？ 1 限制酶的发现 20世纪30年代初发现噬菌体在不同菌株之间的限制现象与不受限制现象， 60年代提出对上述现象解释的假设: 内切酶能识别并切断外源DNA的某些位点使其失活而限制外来噬菌体的繁殖，属限制酶类 。 说明： K菌株和B菌株中有一种限制系统，可以排除外来的DNA。 C菌株不能限制来自K菌株和B菌株的DNA。 这种限制作用就是限制酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。 限制酶的功能： 降解外源DNA，从而阻止其复制和整合到宿主细胞中。 修饰酶的功能： 对自身某个碱基进行甲基化，从而保护自身的DNA不被降解。 核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的酶。 核酸内切酶：从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂成小片断。 核酸外切酶：从核酸分子的末端开始逐个地切割降解核苷酸。 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease）： 一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并切割DNA双链结构的内切核酸酶。 偶数核苷酸组成的识别序列，以中线为轴，两侧核苷酸互补对称。 E. coR I GAATTC CTTAAG 奇数核苷酸组成的识别序列，以 N N 为轴，两侧核苷酸互补对称。 GTNAC CANTG 根据识别序列的规律性，找可能的识别序列。 偶数序列，先找GC、CG、AT、TA，然后找其两侧的核苷酸。 NGCN NATN NCGN NTAN 奇数序列，先找GNC、CNG、ANT、TNA，然后找其两侧的核苷酸。 NGNC N NANTN NCNGN NTNAN N代表任意碱基。 一般说，在同一个DNA分子中，识别序列短的出现的概率大，反之概率小。 原则上有n个碱基的识别序列的出现概率是1/4n 。 如Sau 3A 识别序列GATC，间隔256(44)个核苷酸就有一次机会出现这个识别序列。 E. coR I GAATTC ？？ 在一个环状DNA分子上，若某种限制酶有n个识别序列，经完全酶切后产生n个DNA片段。 在一个线性DNA分子上，若某种限制酶有n个识别序列，经完全酶切后产生n+1个DNA片段。 富AT的识别序列在富AT的DNA分子中出现的概率高，在富GC的DNA分子中出现的概率低。 富GC的识别序列？？ 出现概率低的限制性核酸内切酶称稀切酶(rare cutting enzymes)。 有的限制酶可识别两种以上的核苷酸序列。 例： Acc I GTATAC GTCGAC Dde I CTAAG CTTAG CTGAG CTCAG 黏性末端(sticky end)：DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸形成的末端结构， 它们能通过互补碱基间的配对而重新连接起来。