双光子生物荧光显微技术中的探针问题-物理化学学报.PDF

第 23卷 　第 1期 大 学 化 学 2008年 2 月 今 日化学 双光子生物荧光显微技术中的探针问题 于晓强 　陶绪堂 　蒋民华 (山东大学晶体材料国家重点实验室 　济南 250 100) 　　摘要 　近年来 ,双光子材料及其相关应用技术的研究引起了人们的广泛关注 ,并取得了很好 的进展 。其中 ,双光子生物荧光显微技术受到了特别重视 。本文重点介绍这一技术在生物荧光成 像方面的优势 , 同时深入探讨了该技术面临的缺乏高效双光子荧光探针的问题 ,总结了双光子荧 光探针材料的发展现状和前景 。 ( ) 　　活性生物组织与细胞及其内部物质 离子 、蛋白质 、酶 、核糖核酸等 的纵深方向的大深 度 、高精度的断层荧光探测和成像 ,是医学与生命科学领域面临的挑战性课题 。20 世纪 80 年 ( 代发展起来的新型高精度显微镜 ———激光扫描共聚焦显微镜 la ser scann ing confocal m icro sco p y) ,辅以可与被测物质特异性结合的各种荧光探针或标记染料 ,可以对活细胞的结构及其内 部物质进行实时动态的观测和检测 [ 1 ] 。激光扫描共聚焦显微镜依赖小孔光阑成像原理隔离 背景光并实现纵深方向的断层扫描 。但这一技术依然存在明显缺点 :生物组织和细胞内蛋白 质氨基酸残基和血红蛋白等生物大分子发色团对紫外 可见区激发光的吸收、细胞和组织瑞利 ( ) 散射 、检测器端共焦小孔光阑对荧光收集效率的强烈损失 只对未经散射的光子成像 、焦平 面外的激发区域背景荧光干扰和光生物损伤区域大等 。最近 , 以脉冲激光为激发光源的双光 子荧光探测和成像技术的出现为解决这些问题带来了希望 , 目前已有商品双光子荧光显微镜 出售 [ 2 ] 。但双光子荧光探针的研究则相对滞后 [ 3 ] , 已有的针对激光扫描共聚焦显微镜的单光 子荧光原理开发的商品探针的双光子荧光活性吸收截面偏小 ,因而所用激发激光的光强偏大 , 易造成生物样品热损伤 ,限制了双光子荧光显微技术的广泛应用 。从 目前的应用效果看 ,激光 扫描共聚焦显微镜可以在二维平面上给出高精度的荧光成像 ,但在三维成像方面仍然存在着 不足之处 。对于生命科学的研究工作来讲 ,给出细胞中生理活动的三维信息是非常重要的 ,双 光子荧光显微技术恰好具有较大的优势 。荧光显微探测技术与荧光探针是相互依存互相促进 的 ,新的荧光技术需要新的探针 ,新的探针将使探测技术更加完善 。因此 ,发展高效的双光子 荧光探针材料是一个重要的科学命题 。 1　双光子吸收材料的概念 　　有机分子能够吸收一个光子使其处于前线轨道的电子跃迁到高能级 ,这一过程为紫外 可 见吸收 [ 4 ] ,在此过程中电子吸收一个光子 ,可称为单光子吸收 。最近人们从大量的实验中发 现 :在脉冲激光的激发下 ,具有大的 π电子共轭体系和较大的跃迁偶极距的有机分子能够同 1 时吸收两个光子使其前线轨道的电子跃迁到高能级 ,这个过程称为双光子吸收过程 [ 5 ] 。单光 子吸收和双光子吸收过程遵循不同的选择定律 [ 6 ] 。能够发生双光子吸收过程的材料称为双 光子材料 。目前经常报道的双光子材料包括有机小分子 [ 7 ] 、有机 /金属配合物 [ 8 ] 和大分子 [ 9 ] 。 紫外 可见吸收是线性过程 ,双光子吸收是非线性过程 。在两个过程中跃迁到高能级的分子都 ( [ 10 ] [ 11 ] ) ( [ 12 ] [ 13 ] ) 能够引发各种光物理过程 如荧光 、激射 等 和光化学反应 聚合 、控释 等