分子生物学--定点诱变与蛋白质工程幻灯片.pptVIP

5′ AGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCA 3′ 3′ TCCGAAACGGCTATCCGGT ATTCGT 5′ 变性 退火 5′ AGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCA 3′ ATTCGT 5′ 5′ AGGCTT 3′ TCCGAAACGGCTATCCGGT ATTCGT 5′ 延伸 5′ AGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCA 3′ 3′ TCCGAAACGGCTATCCGGT ATTCGT 5′ 5′ AGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCA 3′ 3′ TCCGAAACGGCTATCCGGT ATTCGT 5′ PCR定点诱变又称为PCR寡核苷酸定点诱变，该法具有简单、快捷的特点，其基本原理及操作程序如下： ①将待诱变靶基因克隆到质粒载体上，并分装到两个反应管中； ②在每一个反应管中加入两种特定的引物，其中引物1和3均含有错配核苷酸，但两个引物分别与质粒DNA的不同链不完全互补，引物2和4均不含有错配核苷酸，二者分别与质粒DNA的引物1和3杂交链的互补链完全互补； ③进行PCR扩增获得含有突变碱基的线型质粒DNA； ④将两个反应管中的线型质粒DNA混合，再经过变性和复性，一个反应管中的一条链和另一个反映管中的互补链杂交，通过两个粘性末端形成带有缺口的环状DNA分子； ⑤转化入大肠杆菌，环状DNA分子的缺口可被大肠杆菌修复。如果同一反应管中的两个互补链又互相杂交，则继续形成线状DNA分子，在大肠杆菌中不稳定，易被降解。该方法把特异突变点导入克隆基因，无需把基因插入M13中，即可在大肠杆菌中进行表达。 PCR进行寡核苷酸 定点诱变的示意图 第二节 蛋白质工程 一、蛋白质工程概论 基因工程诞生10周年之际著名科学家Kevin M.Ulmer于1983年在SCIENCE(VOL.219)发表了论文?Protein Engineering?,该文的摘要是: The prospects for protein engineering ,including the roles of x-ray crystallography,chemical synthesis of DNA ,and computer modeling of protein structure and folding,are discussed.It is now possible to attempt to modify many different properties of proteins by combining information on crystal structure and protein chemistry with artificial gene synthesis.Such techniques offer the potential for altering protein structure and function in ways not possible by any other method. 该文的发表标志着作为生物工程三大技术之一的蛋白质工程诞生了。 （一）蛋白质工程的概念 Protein Engineering 蛋白质工程是在重组DNA技术应用于蛋白质结构与功能研究之后发展起来的一门新兴学科。所谓蛋白质工程，就是通过对蛋白质已知结构和功能的了解，借助计算机辅助设计，利用基因定点诱变等技术，特异性地对蛋白质结构基因进行改造，产生具有新的特性的蛋白质的技术，并由此深入研究蛋白质的结构与功能的关系。 蛋白质工程是在遗传工程取得的成就的基础上，融合蛋白质结晶学、蛋白质动力学、计算机辅助设计和蛋白质化学等学科而迅速发展起来的一个新兴研究领域，它开创了按照人类意愿设计制造符合人类需要的蛋白质的新时期，因此，被誉为第二代遗传工程。蛋白质工程的出现，为认识和改造蛋白质分子提供了强有力的手段。 （二）蛋白质工程的理论基础 1.工、农业以及医药卫生事业