分子生物学基础试验课件.pptVIP

;分子生物学基础实验;实验要求;一、? 质粒DNA小量制备的实验原理;作为基因工程的载体必须具备下列条件;质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1－120kb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。;质粒在细胞内复制的两种类型;分离质粒DNA的三个基本步骤:;质粒DNA的相对分子量一般在106－107范围内，如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×106，质粒pUC19的相对分子质量为1.7×106。 在细胞内，共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂??分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫作开环DNA（open circular DNA，简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。 ;二、实验目的与内容;三、实验材料和试剂;高压蒸汽灭菌锅;超净工作台;台式高速离心机;恒温摇床;恒温培养箱;试剂;LB培养基的配制;微量移液器（pipetman）的使用;; 微量移液器的构造;微量移液器的操作;微量移液器的操作;离心机的使用;电子天平的使用;微波炉的使用;四、操作步骤;(二) 从菌落中快速提取制备质粒DNA;2. 弃上清，加入150μL GET缓冲液，充分混匀，在室温下放置10min。 ;3. 加入200μL新配制的0.2mol/L NaOH(内含1％ SDS)，加盖，颠倒2～3次，使之混匀，冰上放置4min，最多不能超过5min。 ;4 加入150μL冰冷的乙酸钾溶液。加盖后，颠倒数次使之混匀，冰上放置15min。;5. 4℃，10000r/min，离心5min，上清液吸至另一干净的1.5mL Ep离心管中，如上清液浑浊则需重新离心一次。;6. 于上清液中加等体积酚/氯仿液，振荡混匀，4℃，12000r离心2min，小心吸取上清液，转移至另一1.5mL Ep管中，注意勿将两液相中间的白色蛋白薄层吸出。;7. 向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，室温放置３min。用离心机于10000rpm离心5min。;8. 小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。;9. 用0.5mL 70％乙醇洗涤沉淀一次，除尽乙醇，室温自然干燥，备用。;10. 用25uL含无DNA酶的胰RNA酶(20 ug／mL)的TE重新溶解DNA，贮存于-20℃备用，可长期保存。;五、注意事项;4．苯酚可以用于抽提纯化DNA，由于苯酚的氧化产物可以使核酸链发生断裂。所使用的苯酚在使用前必须经过重蒸，且都必须用0.1mol/LTris-HCl (pH7.6)进行平衡。所以取酚/氯仿/异戊醇时应取下层溶液，因为上层是Tris-HCl液隔绝空气层。 5．酚/氯仿/异戊醇抽提时，应充分混匀。经酚/氯仿/异戊醇抽提后，吸取上清液时注意不要把中间的白色层吸入，其中含有蛋白质等杂质。 6．有些质粒本身可能在某些菌种中稳定存在，但经过多次移接有可能造成质粒丢失。因此不要频繁转接，每次接种时应挑单菌落。;六、问题和思考;七、实验报告;八、实验考核